Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 45

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 130 >> Следующая

Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствительность и разрешающая способность окраски флюоресцамином примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок зависимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количества белка больше — вплоть до 7 мкг белка на 1 см2 в пятне или полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не далее, чем для 3 мг/см2.
Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974]. Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации
«9
4*
0,5—1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфэтном буфере (pH 8,5) с 5% ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора флюоресдамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза. Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично использовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофорезом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано использование для окрашивания белков перед электрофорезом родственного фладоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-ди-фенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин, этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе, не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.
В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирующего продукта — при 390 нм, флюоресценции — при 745 нм. Реакция идет лучше в щелочной среде (pH 9,5.) Продукт устойчив в интервале pH 2—10. Интенсивность флюоресценции — в 2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь незначительно уменьшается в случае предварительной обработки белка ДДС-Na и p-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствительность метода очень высока: по утверждению авторов, им удавалось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличие от флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких месяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окрашивание ведут в 0,01 М боратном буфере (pH 9,5), энергично перемешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.
Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделением электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды, обработанные ДДС-Na и fj-меркаптоэтанолом, окрашивали в 0,1 М Li-боратном буфере (pH 9,5), добавляя к ним в пятикратном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.
Амин Флуоресцирующий
продукт
МДФФ
Ортофталевый альдегид , (ОФА) в присутствии [5-меркапто-
этанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов, давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с приведенной ниже схемой.
ОФА Флуоресцирующий продукт
ОФА растворим в воде, но лучше — в метаноле, этаноле, ацетоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при pH 3—9. При использовании ОФА его сначала растворяют в одном из перечисленных органических растворителей, а потом смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и значения pH. Максимум возбуждения флюоресцирующего продукта — при 340 нм, флюоресценции — при 445 нм. Раствор самого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода — выше, чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных продуктов выражен сильнее.
Использование ОФА для окрашивания комплексов белок— ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфэт-ном буфере (pH 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% 0-меркап-тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда добавляли Vs объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и выдерживали в темноте 2—3 ч.
Локализация ферментов после электрофореза
В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях (без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности. Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с помощью специфических реакций, дающих окрашенные продукты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофакторов, необходимых для протекания определенной ферментативной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует, его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продви-. жением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять,, каково будет поведение субстрата в электрическом поле во время электрофореза.
Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом («индикаторном») геле на основе агарозы или импрегнировать ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность накладывают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикаторных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в качестве заключительного этапа реакции воспользоваться неферментативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана, что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продукты (схема реакции приведена ниже).
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed