Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. Подготовка клеток
Лимфоциты и эритроциты Xenopus получают так, как было описано выше, и после промывки ресуспендируют в среде МСИД+ 10% инактивированной нагреванием СПК до концентрации 1,5-106 клеток/мл (для крупных эритроцитов) или ЗХ XЮ6 клеток/мл (для лимфоцитов).
3. Проведение теста
К 2 мкл антисыворотки добавляют 2 мкл клеточной суспензии. Для проверки клеток, среды и комплемента ставят соответствующие контроли. После встряхивания на вортексе пане-
ли оставляют при комнатной температуре на 20 мин.
Пастеровской пипеткой в каждую лунку вносят по капле среды. Через 10 мин капли стряхивают так, чтобы клетки остались на дне лунок. Затем в лунки добавляют по 2 мкл кроличьего комплемента, адсорбированного клетками Xenopus. Панели встряхивают на вортексе и инкубируют при 37 °С без СОг. Действие комплемента останавливают, выдерживая панели 10 мин при 4°С, а затем клетки фиксируют, добавляя в каждую лунку по капле 5%-ного формальдегида в ЗФР. Через 5—10 мин все лунки осторожно накрывают покровным стеклом и просматривают в фазово-контрастном микроскопе. Процент цитотоксичности выражают отношением числа лизированных клеток, которые выглядят черными или серыми, к числу живых клеток, сохраняющих свои светопреломляющие свойства.
32—1278
498 Глава 25
VII. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ИММУННОГО ОТВЕТА
А. Антителообразование и синтез иммуноглобулинов
1. Индукция антителообразования in vivo или in vitro
Для индукции антителообразования in vivo взрослых животных или личинок иммунизируют конъюгатом ДНФ—KLH или клеточными антигенами. Дозы антигена могут варьировать от 2 до 10 мкг/г массы тела животного. Для исследования кинетики антителообразования вводят антиген и затем два раза в неделю берут кровь для анализа. Когда исследуют in vitro процесс вторичного антителообразования, лимфоциты получают от животных, прошедших первую иммунизацию, обрабатывают их, как описано в разд. IV, и затем культивируют в присутствии антигена в концентрациях 1—10 мкг/мл среды. Условия индукции in vitro первичного ответа на лимфоцитарный антиген пока не отработаны.
2. Определение титров антител
с использованием методов инактивации бактериофага (адаптированная методика Adams, 1953; Jerne, Avegno, 1956)
Принцип этого методического подхода состоит в том, что суспензию бактериофагов (или бактериофагов, конъюгированных с гаптеном) обрабатывают антителами и оценивают их инактивацию во времени. На практике удобно выбрать какой-либо фиксированный временной интервал и сравнивать действие нескольких разведений антител.
Пробы инкубируют в панелях Терасаки, в лунки которых вносят по 10 мкл соответствующих разведений антисыворотки или перитонеальной жидкости. Параллельно в качестве контроля в лунки вносят такие же разведения нормальной сыворотки, а в две лунки — раствор, используемый для приготовления разведений. Для создания влажной атмосферы по периферии панелей наливают воду, и во время работы стараются как можно реже их открывать, чтобы свести к минимуму испарение жидкости. В лунки добавляют по 5 мкл суспензии бактериофагов в фосфатном буфере с желатиной (состав буфера см. в приложении) .содержащем 20% питательного бульона (для того чтобы предохранить фаги от разрушения в ходе длительной инкубации). Число фаговых частиц (в единицах образования зон лизиса) в 5 мкл этой суспензии должно составлять ~ 1000. Закрытую панель Терасаки помещают во влажную атмосферу в стек-
Изучение иммунной системы Xenopus
499
лянный сосуд с крышкой и инкубируют при 37 °С обычно в течение 2ч. Это время инкубации было подобрано эмпирически при работе с лягушками, у которых уровень содержания антител ниже, чем у млекопитающих. Диапазон трехкратных разведений сыворотки или перитонеальной жидкости составляет обычно 1: 10—1: Ю5 (1: 10, 1:30, 1: 100 и т. д.). При тестировании культуральных жидкостей следует использовать цельную культуральную жидкость и ее разведения до 1:300, а время инкубации — увеличить до 4 ч.
На следующем этапе смесь бактериофагов и антител добавляют к культуре Е. coli В. После инкубации 5 мкл жидкости, содержащей бактериофаг и антитела, смешивают с 1 мл бактериальной культуры в логарифмической фазе. При постановке теста следует принимать во внимание, что при 37°С первые бляшки появляются уже через 25 мин. На практике это означает, что каждую партию проб нужно готовить при комнатной температуре, укладываясь в 25-минутный интервал. После некоторой тренировки за это время удается подготовить партию из 48 проб.
Инфицированные фагом бактерии вносят в пробирки с заранее подогретым мягким агаром (состав см. в приложении) и выливают его в чашки Петри с питательным агаром Херши (состав см. в приложении).
После затвердения агара накрытые крышками чашки Петри переворачивают (чтобы избежать стекания капель воды с крышек) и инкубируют их в течение ночи при 37°С. На следующий день зоны лизиса (бляшки) подсчитывают на счетчике бактериальных колоний.
По числу бляшек можно определить эффективность инактивации фага по следующей формуле:
