Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Изучение иммунной системы Xenopus
485
В. Получение макрофагов от взрослой лягушки
Макрофаги могут быть использованы для улучшения образования антител in vitro или для повышения жизнеспособности соматических клеток лягушки при их слиянии.
Животных анестезируют и вводят им внутрибрюшинно 10— 20 мл (для крупных самок весом 150—300 г) 10%-ного раствора сахарозы. Иглу из брюшной полости после такого введения сахарозы не вынимают. Осторожно массируют живот лягушки, берут ее в левую руку и переворачивают вниз животом. При этом под действием силы тяжести в шприц поступает жидкость. Иглу шприца стараются держать как можно ближе к месту входа в полость, чтобы свести к минимуму возможность ее блокировки тканями. Таким образом можно получить около 2/3 исходно введенного объема жидкости. Клетки промывают ЗФР с глюкозой (состав раствора см. в приложении), который препятствует агрегации макрофагов. Число клеток, получаемых от одного животного без введения тиогликолата, варьирует от
0,5-106 до 2-106.
Г. Разделение клеточных популяций
Для некоторых целей может понадобиться обогащение популяции лейкоцитов лягушек клетками того или иного типа, например Т- или В-лимфоцитами. Для этого с успехом применяют два метода, которые обычно используют в иммунологических исследованиях млекопитающих: разделение клеток на
нейлоновой вате и селекция клеток по их способности связываться с моноклональными антителами к иммуноглобулинам, так называемый Ig-пэннинг.
1. Разделение на нейлоновой вате
(Julius et al., 1973, с изменениями)
Нейлоновую вату из фильтров для разделения лейкоцитов Leuko-Pak (Fenwal Laboratories, США) шесть раз кипятят в дистиллированной воде, а затем высушивают при 37 °С. Взвешивают порции ваты по 1 г, измельчают их, чтобы удалить все узлы и комки, набивают в шприц объемом 10 мл до отметки 7,8 мл и автоклавируют. Перед использованием шприцы, которые мы далее будем называть колонками, инкубируют в течение 1 ч со стерильным изотоническим буфером, содержащим 5% СПК (ЗФР для амфибий-b СПК) при той температуре, при которой будет происходить разделение клеток. Сравнение результатов разделений при 27, 30 и 37 °С показало, что опти-
486 Глава 25
мальной является температура 30 °С, при которой обычно и проводят подобные исследования (Blomberg et al., 1980).
После подготовительных процедур в колонку по каплям добавляют 1 мл клеточной суспензии (0,5—1-107 клеток/мл). За этим процессом удобно наблюдать по феноловому красному, присутствующему в культуральной среде. Клетки смывают в колонку 1—2 мл ЗФР—СПК и инкубируют в течение 1 ч при 30 °С.
Клетки, не прилипшие к вате, элюируют 15 мл ЗФР—СПК. Скорость тока буфера должна быть такой, чтобы он выходил из колонки отдельными каплями. Элюированные клетки промывают в среде и используют в опытах in vitro. Для получения прилипших к вате клеток ее извлекают из колонки, измельчают в чашке Петри со средой и энергично отжимают стерильным пинцетом.
2. Пэннинг
Применительно к лимфоцитам лягушки эту методику описали Блейхер и Коэн (Bleicher, Cohen, 1981).
При нанесении на твердую фазу антител, очищенных на колонке с белком А, их концентрация в растворе может составлять
0,1 мг/мл. Неприкрепившимися клетками считаются те, которые не связываются достаточно прочно с «подложкой» из моноклональных антител в течение 1 ч.
Высвобождение прикрепившихся к «подложке» клеток (сюда входят и В-лимфоциты) основано на эффектах кэппиига и слущивания (шеддинга) поверхностных иммуноглобулинов. Чашки Петри с прикрепившимися клетками в полной культуральной среде оставляют на ночь в инкубаторе при температуре 27 °С. На следующий день после слущивания связавшихся с антителами рецепторов клетки легко отделяются от «подложки» при осторожной промывке. Следует отметить, что жизнеспособность клеток после такого кратковременного культивирования сохраняется на высоком уровне.
V. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ
Одним из недостатков при работе с конкретным экспериментальным объектом является отсутствие необходимых для иммунологических исследований специфических реагентов. Поэтому реагенты против иммуноглобулинов, антигенов МНС и антигенов клеточных поверхностей приходится готовить самим, получая соответствующие антисыворотки (ксено- или аллосыворотки) или моноклональные антитела.
Изучение иммунной системы Xenopus
487
А. Получение антисывороток
1. Антисыворотки к растворимым антигенам
и ксеноантигенам
Между амфибиями и млекопитающими имеются существенные различия в кинетике процессов антителообразования. Для лягушек характерен сильный иммунный ответ, но при температуре, благоприятной для млекопитающих (23 °С), он обычно развивается медленно (максимум образования антител приходится на третью — четвертую неделю после иммунизации). У Xenopus были получены антисыворотки удовлетворительного качества к динитрофенолу, конъюгированному с гемоцианином моллюска фисуреллы, и к растворимым аллоантигенам (сывороточным белкам других подвидов Xenopus или других видов животных).
