Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
После однократного центрифугирования при 800 об/мин в течение 5 мин клетки ресуспендируют в свежем фиксирующем растворе, выдерживают 30 мин во льду, дважды промывают в фиксирующем растворе и ресуспендируют в нескольких каплях этого же раствора. После такой обработки клетки готовы для нанесения на стекла (спрединга).
Обезжиренные предметные стекла еще раз промывают смесью этанол — эфир (1:1) и протирают полотенцем, смоченным в этом же растворе. Стекла высушивают и хранят до использования на сухом льду. На охлажденное стекло наносят каплю клеточной суспензии с высоты примерно 80 см. Жидкость растекается по поверхности стекла и быстро испаряется. В момент, когда испарение почти полностью завершено и поверхность стекла выглядит чуть влажной, стекло быстро погружают в 50%-ную уксусную кислоту (50% кислоты, 50% воды) и сразу высушивают на плоской пластине при 40 °С. Этот прием абсолютно необходим для получения хорошей дисперсии материала при работе с лимфоцитами Xenopus. Хромосомы видны без окрашивания в фазово-контрастном микроскопе. Описаны кариотипы различных видов Xenopus (Tymowska, 1977; Tymowska, Kobel, 1972; Tymowska, Fischberg, 1982).
X. ПРИЛОЖЕНИЕ
ГКН-буфер
(на 1 л)
Г люкоза 2 г
KCI 0,4 г
NaCl 8 г
Na2HP0*-2H20 1,77 г
NaH2P0*-H20 0,69 г
-Феноловый красный 0,01 г
н2о 1000 мл
pH 7,2; автоклавируют 20 мии при 120 °C, хранят при комнатной температуре
510 Глава 25
Продолжение
Фосфатный буфер (0,05 М)
с желатиной (на 1 л)
NaH2P04 3,5 г
Na2HP04 4,5 г
Желатина 0,1 г
Н20 1000 мл
pH 6,8; автоклавируют
Агар Хершн
Агар 12 г
Триптон 13 г
NaCl 8 г
Цитрат натрия-5Н20 2,8 г
Глюкоза 1,3 г
н2о 1000 мл
Автоклавируют
Мягкий агар
Триптон (Difco 012301) 10 г
NaCl 8 г
Агар 6 г
н2о 1000 мл
pH 7,8
Бульон Херши
Питательный бульон (Difco 0003.01) 8 г
NaCl 5 г
Среда с глюкозой
(на 1 л)
Бактопептон (Difco 011801) 5 г
Глюкоза 1 г
Н20 1000 мл
pH доводят до 7,2 с помощью NaOH
Изучение иммунной системы
511
Продолжение
Среда L15 Лейбовица
Среда Gibco 430 1300, разведенная Н20 Среда L15 разведенная
н2о
NaHC03 (15 г/л)
2-МЭ (0,1 М)
ГЭПЭС (1 М) (М. A. Bioproducts) Пенициллин (10 000 ед./мл) Стрептомицин (10 000 мкг/мл)
200 мл 64 мл 32 мл 0,064 мл
3.2 мл
3.2 мл смеси
Гель для ИЭФ
Раствор А:
Раствор Б:
Раствор В:
Для четырех
3,5%-ных гелей
5%-ный (по объему) М.М.М'.М'-тетраметилэтилеи-днамин (ТЕМЭД)
100 г акриламида 2,7 г 1М,]М'-метиленбнсакриламида 300 мл Н20
2 мг рибофлавина илн 10 г персульфата аммония 100 мл Н20 Раствор А (1 мл)
Раствор Б (21 мл)
Амфолины, pH 5—8 (10 мл)
Деионизованная мочевина (8 М) (75 мл)
Н20 (75 мл)
Раствор В (20 мл)
Смесь дегазируют и наслаивают на покрытые желатиной (Ilford) стеклянные пластины 16x22 см (45 мл смеси на 1 гель). Полимернзуют во влажной -атмосфере азота.
Литература
Adams М. Н. (1953). Ann. N. Y. Acad. Sci., 56, 442.
Amos D. В., Bashir H., Boyle W„ McQueen М., Tiilikaineti A. (1969), Transplan» tation, 7, 220.
Bernard С. C. A., Bordmann G„ Blomberg B., Du Pasquier L. (1979). Immuno genetics, 9, 443.
Bernard С. C. A., Bordmann G., Blomberg B., Du Pasquier L. (1981). Eur. J. Immunol., 11, 151.
Bernardini N.. Chardonnens X., Simon D. (1969). C. R. Acad. Sci. Paris, 269, 1011.
Bleicher P. A.. Cohen N. (1981). J. Immunol., 127, 1594.
Blomberg B., Bernard С. C. A., Du Pasquier L. (1980). Eur. J. Immunol, 10 869.
