Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Если необходимо получать антисыворотки с высокими стабильными титрами антител, то антигены следует вводить с адъювантом. С этой целью используют два метода. Антиген можно вводить (доза 2—10 мкг на животное) после эмульгирования в полном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно, причем объем не должен превышать 0,1 мл/100 г массы животного, так как адъювант токсичен. (Инъекции с адъювантом в дорсальные лимфатические мешки часто приводят к гибели животных.) Как альтернативный метод можно предложить преципитацию антигена квасцами и введение его с Bordetella pertussis (эти микроорганизмы токсичны, поэтому их концентрация не должна превышать 4-108 мл-1 для взрослых животных и 1/10 этой концентрации для головастиков). Кинетика антителообразования при этом такая же, как и при иммунизации животного с адъювантом Фрейнда. Можно проводить гипериммунизацию животных повторными инъекциями антигена, но в этом случае «разрешающее» введение антигена следует осуществлять тогда, когда снизятся титры антител в сыворотке крови. Обычно кровь у животных берут через две недели после последней инъекции. В сыворотках крови гипериммунизированных животных выявляется большое количество IgY, особенно если их содержат при высоких температурах (23—26°С). Температура 19 °С слишком низка для получения хорошего ответа, а при 29 °С животные находятся в очень возбужденном состоянии. При 30 °С животные через короткий промежуток времени гибнут.
Антисыворотки к растворимым антигенам можно исследовать с помощью обычных методов иммунопреципитации. При этом более оптимальными условиями для преципитации будет половинная ионная сила буферов, используемых обычно в работе с млекопитающими (Roth, Schneider, 1971). Если имеются
488 Глава 25
«вторичные» реагенты против иммуноглобулинов амфибий, то можно использовать радиоиммунологические тесты или имму-ноферментный анализ (ELISA). Можно также проводить определения, основанные на лизисе сенсибилизированных антигеном эритроцитов, так как IgY связывают комплемент.
2. Антисыворотки к корпускулярным антигенам
В данном случае наилучшие результаты удается получить при многократных инъекциях небольших доз антигенов (бактерий, клеток и т. п.). Троекратное введение шпорцевым лягушкам (массой до 30 г) 5-106 бараньих эритроцитов приводит к такому же хорошему ответу, как одноразовая инъекция 1 • 10® клеток. Титры антител в сыворотках крови достигают максимума обычно через 4 нед.
3. Антисыворотки к корпускулярным аллоантигенам
Эти антисыворотки наиболее полезны для исследований полиморфизма в пределах вида. К сожалению, их получение часто оказывается затруднительным, особенно антисывороток к антигенам МНС. Дело в том, что методики, дающие наилучшие результаты при получении аллоантисывороток, включают предварительную трансплантацию кожи животному, предназначенному для иммунизации. После полного отторжения трансплантата животному делают «разрешающие» инъекции эритроцитов или лимфоцитов от донора кожи (несколько миллионов клеток на инъекцию для лягушки массой 50—100 г; без адъюванта) и берут у него кровь через 2 нед после последней иммунизации. Если титры антител высокие, а специфичность антисыворотки соответствует ожидаемой, то кровь у животных можно брать повторно через 1—2 нед без дополнительных антигенных инъекций. После этого повторными «разрешающими» инъекциями (например, раз в два месяца) поддерживают образование антител на необходимом уровне.
Б. Моноклональные антитела
Последовательность приемов, используемых для получения моноклональных антител, детально описана (Kohler, 1979), и до сих пор не было отмечено никаких особенностей, характерных для амфибий. Иммунизация мышей иммуноглобулинами амфибий, очищенными на колонках с белком А, позволяет получать впоследствии многочисленные aHTH-Ig-клоны. Моноклональные антитела против антигенов МНС амфибий получить
Изучение иммунной системы Xenopus
489
Таблица 25-2. Свойства моноклональных антител против иммуноглобулинов Xenopus
Моноклональные антитела
10А9 14G1 11D5 4B3 10C10 14B4 I4F11 6FI0 13B2
(14А11) (14D5)
Класс иммуно Yi Yi Yi Yi Yi IgM,
глобулинов IgY
Прецип итируют IgM IgM IgV IgY- IgM, IgY IgM, IgY IgM, IgM
Ig A', laevis Все Все Все Все Субпопу Субпопу IgY
Специфичность IgM IgM IgY IgY ляция ляция Субпо
IgM и IgY IgM и пуля
IgY ция
IgM и
IgY
Вестерн-блот- И НИ1) V НИ И-. v И-. v НИ НИ Лег
тинг кая
