Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 221

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 215 216 217 218 219 220 < 221 > 222 223 224 225 226 227 .. 239 >> Следующая

Изучение иммунной системы Xenopus
495
4. Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле
Электрофорез проводят в соответствии с оригинальной методикой Леммли (Laemmli, 1970). Градиентные гели с концентрациями акриламида 7—15% готовят, заливая соответствующие растворы между двумя стеклянными пластинами с помощью градиент-смесителя. Получают гели толщиной 0,75 мм, длиной 21 см и шириной 16 см. Полимеризация геля наступает через 1 ч после наслаивания на него изобутилового спирта. Применяют 4%-ный концентрирующий гель, в котором с помощью шаблона делают 17 или 26 карманов для нанесения образцов. Электрофорез проводят при постоянном токе (8 мА).
5. Флюорография
Гели с фракциями 35S-полипептидов отделяют от стеклянных пластин и помещают на 30 мин в фиксирующий раствор (12 частей воды, 7 частей этанола, 1 часть уксусной кислоты). Гели два раза по 30 мин промывают диметилсульфоксидом (ДМСО), после чего импрегнируют 25-дифенилоксазолом (англ. сокращение РРО) в смеси ДМСО—РРО (18% РРО в чистом ДМСО) в течение 2 ч (Bonner, Laskey, 1974). Затем гели промывают 6 раз в дистиллированной воде в течение 1 ч и высушивают на фильтровальной бумаге Whatman 0,ЗЗММ в аппарате для высушивания гелей фирмы Bio-Rad (модель 224). Высушивание обычно завершается через 90 мин. Альтернативным вариантом является фиксация и импрегнирование гелей в один этап погружением в раствор Enlightening (New England Nuclear) на 20 мин при комнатной температуре.
Гели с белками, меченными иодом, фиксируют, промывают три раза в воде, высушивают и радиоавтографируют, применяя отражающие экраны для усиления сигнала.
В. Иммунофлуоресценция
Для изучения клеток лягушек применяют классические им-мунофлуоресцентные методы (Forni, 1979) без каких-либо изменений. Удобство и простота гистологической обработки материала в случае Xenopus весьма облегчают проведение иммуно-флуоресцентных исследований, особенно анализ зародышей и головастиков. Известны очень хорошие модификации иммуно-флуоресцентного анализа (Hausen, Dreyer, 1981). Здесь мы остановимся на быстром методе, адаптированном для изучения тканевого распределения антигенов МНС и других антигенов, имеющих отношение к иммунной системе. Этот метод можно использовать также для скрининга моноклональных антител.
496 Глава 25
Головастиков или соответствующие органы замораживают на сухом льду и заключают в среду ОСТ (Tissue Тек II, 4583 Miles). Срезы получают при температуре —18°С на криотоме, помещают их по одному в лунки специальных стекол (Н. Но1-zel) и фиксируют 30 с в ацетоне. Затем срезы инкубируют с первым реагентом: моноклональными антителами или аллоантисывороткой к МНС. Хорошие результаты получают при длительной инкубации (например, в течение ночи при 4°(С), которая особенно важна в случае использования слабых аллоантисывороток.
На следующий день срезы (каждый по отдельности) промывают буфером БСА—ЗФР, содержащим 0,05% твина 20, и инкубируют их со вторым реагентом. В качестве последнего можно применять смесь нескольких типов моноклональных антител против низкомолекулярных иммуноглобулинов Xenopus (если первоначально срезы обрабатывали аллоантисывороткой) или флуоресцентномеченые козьи антитела против иммуноглобулинов мыши (при скрининге моноклональных мышиных антител, связавшихся на первой стадии с клетками Xenopus). Продолжительность инкубации 1 ч при комнатной температуре. После промывки срезов буфером БСА—ЗФР их заключают в этот же раствор, содержащий 20% глицерола, и исследуют с помощью микроскопа, используя объектив (Leitz) большой светосилы с 50-кратным увеличением под водной иммерсией.
Г. Гемагглютинация
Для скрининга больших семейств или аутбредных популяций Xenopus на наличие определенных антигенов иногда наилучшим методом оказывается гемагглютинация с соответствующими аллоантисыворотками. Антисыворотки лягушек часто являются слабыми, и поэтому при их использовании необходимы высокочувствительные методы анализа. Хорошие результаты получают при постановке опытов по следующей методике.
Исследуемые клетки — обычно эритроциты Xenopus — промывают и осаждают центрифугированием. 5 мкл осадка ресуспендируют в 9 мл раствора, имеющего состав: 0,5% БСА,
25 мг/л ПВП, 50 мкл/л твина 20 в ЗФР для амфибий. Готовят серийные разведения соответствующих антисывороток и суспензию вносят по одной капле в лунку панели пастеровской пипеткой. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре панели осторожно центрифугируют (800 об/мин, 1 мин, центрифуга Mistral 4L) и наклоняют их под углом 45°. При этом осадок неагглютинированных клеток сползает со дна лунок. Лунки, в которых клеточный осадок сохраняется на дне в виде
Изучение иммунной системы Xenopus
497
точки, считаются положительными (положительная реакция гемагглютинации). Для документирования результатов можно делать ксерокопии дна лунок.
Д. Цитотоксический микротест с клетками Xenopus (Arnos et al., 1969, с некоторыми изменениями)
1. Подготовка панелей
В лунки панели Терасаки вносят по 2 мкл антисыворотки в соответствующих разведениях. На этой стадии содержимое лунок можно заморозить, смочить края закрытых крышкой панелей солевым раствором и завернуть в фольгу для предотвращения испарения жидкости.
Предыдущая << 1 .. 215 216 217 218 219 220 < 221 > 222 223 224 225 226 227 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed