Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 220

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 214 215 216 217 218 219 < 220 > 221 222 223 224 225 226 .. 239 >> Следующая

Иммунопреципитацию в присутствии кроличьей антисыворотки проводят следующим образом. Раствор с меченым материалом выдерживают 30 мин во льду с нормальной кроличьей сывороткой (10% по объему), после чего добавляют к нему равный объем белка А — сефарозы (Pharmacia). Смесь перемешивают переворачиванием пробирок в течение получаса при 4°С и затем центрифугируют1). К супернатанту добавляют
!) Описанные выше этапы относятся к предварительной очистке, в результате которой из исследуемого образца удаляют меченые компоненты, связывающиеся (в том числе неспецифически) с глобулинами нормальной сыворотки крови кролика. — Прим. ред.
492 Глава 25
кроличью антисыворотку к иммуноглобулинам (5 мкл на образец, что соответствует 5-106 имп/мин) и смесь выдерживают во льду в течение ночи. На следующий день добавляют белок А — сефарозу, смесь перемешивают переворачиванием пробирок в течение получаса при 4°С, центрифугируют, осадок дважды промывают и ресуспендируют в буфере для образца.
5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН
Этот метод описан Такачем и Штеелином (Takacs, Staehe-lin, 1981). Обработанные меркаптоэтанолом образцы разделяют в 10 или 12,5%-ном полиакриламидном геле, а необработанные в 6%-ном или 8%-ном геле в присутствии 0,1% ДСН.
Мол. массы исследуемых полипептидов определяют, используя набор стандартных белков-маркеров. Для пептидного картирования легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов Xenopus пептиды обрабатывают протеазой V8 из Staphylococcus aureus, используя модифицированный метод (Hoessli et al., 1982) Кливленда и др. (Cleveland et al., 1977).
6. Иммунопреципитация после электрофореза
Описываемую ниже методику предложили Такач и Штеелин (Takacs, Staehelin, 1981). Очищенные на колонке с иммобилизованным белком А иммуноглобулины Xenopus (150 мкг) наносят на ДСН-полиакриламидный гель, в концентрирующем геле которого не делают карманов. Иммуноглобулины наносят в буфере для образцов, содержащем 2% МЭ. После электрофореза фракции, соответствующие Н- и L-цепям иммуноглобулинов, переносят из геля на нитроцеллюлозный фильтр (блоттинг; Schleicher, Schiill) и фильтр инкубируют в растворе, содержащем 1% поливинилпирролидона (ПВП), 1% БСА и 5% нормальной кроличьей сыворотки в ЗФР без Са2+ и Mg2+. Затем фильтр разрезают на полоски шириной 0,5 см и каждую из них инкубируют в течение ночи с супернатантом гибридомы, синтезирующей антитела против иммуноглобулинов. После двукратной промывки в ЗФР полоски по отдельности инкубируют с меченными 1251 овечьими антителами против иммуноглобулинов мыши при комнатной температуре в течение 5 ч. После последовательных промывок 1%-ным ПВП в ЗФР,
0,5%-ным твином 20 в ЗФР, ЗФР и дистиллированной водой полоски высушивают и радиоавтографируют.
Изучение иммунной системы Xenopus
493
Б. Иммунопреципитация мембранных полипептидов
Описанные ниже методы пригодны для изучения различных типов молекул клеточных поверхностей Xenopus (иммуноглобулины, антигены МНС).
1. Биосинтетическое течение (см. разд. VI, А, 2)
Так как при работе с антигенами МНС имеют дело с небольшими количествами материала, дозу добавляемого в культуральную среду 355-цистеина или метионина можно увеличить до 1 мКи/мл клеточной суспензии (З-Ю7 клеток/мл). Как уже отмечалось выше, если необходимо получить негликозилиро-ванные молекулы, клетки следует обработать туникамицином, который блокирует гликозилирование по аспарагинам (Tkacz, Lampers, 1975).
2. Мечение поверхностей клеток
Для мечения поверхностей клеток используют методику, описанную Коуном и Маршалонисом (Cone, Marchalonis, 1974). Очищенные популяции лимфоцитов или эритроцитов получают, как описано в разд. IV. Эритроциты отбирают со дна пробирки с фиколлом и отмывают. 2,5-107 клеток ресуспендируют в 75 мкл ЗФР для амфибий. Суспензию выдерживают 10 мин при 27 °С и добавляют к ней 25 мкл раствора лактопе-роксидазы (Calbiochem) с концентрацией 2 мг/мл и 5 мкл
0,5 М фосфатного буфера, pH 7. Затем в клеточную суспензию вносят 500 мкКи NaI25I (Amersham) и 10 мкл 0,003%-ного (по объему) раствора перекиси водорода в ЗФР для амфибий. Смесь энергично перемешивают 4 мин, добавляют 10 мкл 0,03%-ной перекиси и инкубируют еще 10 мин при 27 °С. Иодированные клетки промывают три раза в ЗФР с 2 мМ йодистым калием и
0,02%-ным азидом натрия. После этого клетки лизируют и лизат обрабатывают, как описано в разд. VI, А.
3. Иммунопреципитация
Преципитацию меченых молекул проводят по Каллену и Шварцу (Cullen, Schwartz, 1976). Белок А — сефарозу (300 мг) заливают буфером NET-NON (50 мМ трис-НС1, pH 8; 5 (мМ ЭДТА, 650 мМ NaCl и 0,5% тритона Х-100) и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Затем гранулы сефарозы промывают 3 раза в буфере NET-NO (50 мМ трис-НС1, pH 8; 5 мМ ЭДТА, 150 мМ iNaCl, 1 мг/мл овальбумина и 0,5% тритона Х-100) и ресуспендируют до концентрации 50% (по объе-
494 Глава 25
му), добавляя 1 мл буфера NET-NO. Из отстоявшихся клеточных лизатов отбирают необходимые для преципитации аликвоты (объем, соответствующий 2—5-106 имп/мин, для меченых по поверхности клеток и 5—10 -106 имп/мин для биосинтетически меченых клеток). Чтобы удалить меченые компоненты, которые связываются с белком А и сефарозой неспецифически, лизаты подвергают описанному выше этапу предварительной очистки (разд. VI, А, 4). С этой целью к лизатам добавляют моноклональные антитела 11D5 (мышиные fi-антитела против низкомолекулярных иммуноглобулинов Xenopus; они будут использоваться в дальнейшем в качестве второго реагента) до концентрации 10% (по объему) и смесь инкубируют 1 ,ч во льду. Затем к ней добавляют белок А — сефарозу (50 мкл/100мкл лизата) и выдерживают при 4°С при постоянном перемешивании. После предварительной очистки, целью которой является снижение фона, лизаты центрифугируют для удаления гранул белок А — сефарозы и супернатанты разливают порциями в эппендорфовские пробирки для иммунопреципитации. Преципитацию начинают добавлением к лизатам специфических антител (5 мкл асцитной жидкости или антисыворотки или 100 мкл осветленной культуральной жидкости •гибридом) с последующей инкубацией в течение ночи во льду. На следующий день для непрямой иммунопреципитации к смеси добавляют вторые антитела (в случае преципитаций аллоантисывороткой этот этап обязателен) и выдерживают как минимум 1 ч во льду. К каждому образцу добавляют по 30 мкл -белок А — сефарозы и опять инкубируют 30 мин при 4°С с постоянным перемешиванием. После центрифугирования сефарозу, которая теперь содержит иммунопреципитат, промывают три раза буфером NET-NON, добавляя по 1 мл буфера в каждую пробирку с последующим перемешиванием в течение 30 мин при 4°С. После последней отмывки в пробирки добавляют по 500 мкл буфера NET-.N (50 мМ трис-НС1, pH 8; 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl и 0,5% тритона Х-100), гранулы сефарозы ресуспендируют и переносят в чистые эппендорфовские пробирки. Исходные пробирки споласкивают 500 мкл буфера NET-N, смывая оставшиеся на стенках гранулы сефарозы, и смыв объединяют с первой порцией сефарозы. Гранулы сефарозы •еще раз промывают в буфере NET-N, а иммунопреципитаты, сорбированные на них, солюбилизируют в буфере для электрофореза по Леммли (разд. VI, А, 4) с 2-МЭ или без него. После выдерживания в течение 90 с в кипящей воде образцы центрифугируют для удаления гранул сефарозы. Получаемые при этом супернатанты, содержащие иммунопреципитаты, готовы для нанесения их на гель.
Предыдущая << 1 .. 214 215 216 217 218 219 < 220 > 221 222 223 224 225 226 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed