Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
в среде RPMI — СПК смешивают в пробирке на 10 мл с равным объемом культуральной надосадочной жидкости (профильтрованной через фильтр с порами размером 0,45 мкм) от линии клеток мармозеток В95-8, выделяющей ВЭБ, и добавляют циклоспорин A (Sandoz, Basel, Швейцария) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. После инкубации при 37 °С в течение 16 ч клетки дважды промывают, вновь суспендируют (2-105 клеток/мл) в среде RPMI— СПК, содержащей
0,5 мкг/мл циклоспорина А, и затем культивируют в плоскодонных лунках 24- или 96-луночных панелей в течение 1—
2 нед. Размножающиеся клетки, которые образуют большие агрегаты, наращивают в среде RPMI — СПК в течение неограниченного времени.
При использовании МПК и ЛКЛ в качестве клеток-стимуляторов их облучают в дозе 3000 рад и один раз промывают средой.
Е. Иммуноферментный анализ
Чувствительность методов, используемых для определения иммуноглобулинов (обнаружения антител), должна быть достаточной, для того чтобы можно было выявлять моноклональный продукт от одного активированного предшественника. Благодаря относительно большим размерам клонов В-клеток, образующихся под влиянием Т-хелперных клонов, большинство обычных иммуноферментных методов оказываются достаточно чувствительными и к тому же очень удобными для проведения опытов с помощью лимитирующих разведений. Основные ссылки на применение иммуноферментных методов и приготовле-
Выделение клоиов аллореактивных Т-хелперов
273
------------------------------------------------------------
ние ферментных конъюгатов даны в работе Воллера и др. (Voller et al., 1976).
Изотип-специфический иммуноферментный анализ осуществляют следующим образом. Полистиреновые лунки микропанелей (Dynathech, Billinghurst, Sussex, Англия) обрабатывают в течение ночи при 4°С иммуноглобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к ц-, у- или a-цепям человека, полученной от фирмы Dakopatts (Copenhagen, Дания; 50 мкг/мл IgG в 20 мМ фосфатном буфере, pH 7,5), или мышиными моноклональными антителами Е-45 против е-цепей человека (10 мкг/мл; любезно предоставленными G. Damiani из Генуэзского университета). Лунки промывают ЗФР и вносят в них определенные разведения проб в ЗФР — 5% СПК при комнатной температуре на 2 ч. Лунки промывают и на следующие 2 ч вносят меченные щелочной фосфатазой кроличьи антитела к р,-, у- и а-цепям человека. Для количественного определения IgE добавляют кроличьи антитела к ®-цепи человека, а затем конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антитела к иммуноглобулинам кролика. После окончательной отмывки определяют связанную с лунками ферментативную активность, используя раствор п-нитрофенилфосфата (1 мг/мл) в 10%-ном ди-этаноламиновом буфере, pH 9,8. Оптическое поглощение измеряют на автоматическом фотометре (Flow Multiskan). Для построения стандартных кривых используют стандартную сыворотку или известное количество очищенного иммуноглобулина. Чувствительность теста составляет 10 нг/мл для IgM, IgG и IgA и 0,5 нг/мл для IgE. Примесь очищенного иммуноглобулина постороннего изотипа вплоть до концентрации 10 мкг/мл в тесте не обнаруживается.
III. МЕТОДИКА
А. Отбор аллореактивных Т-клеток
В каждую лунку 24-луночной панели (Costar, Cambridge, МА) содержащую СКЛ, вносят по 106 «отвечающих» МПК и 10® облученных МПК (клеток-стимуляторов) в 2 мл RPMI — 5% СКЧ. Через 7 дней клетки промывают и культивируют по
2-105 живых клеток на 1 мл среды GM, содержащей ИЛ-2. Это приводит к интенсивной пролиферации Т-клеток. Каждые
3—4 дня культуры разбавляют средой GM для поддержания концентрации клеток между 105 и 10® на 1 мл. В этих условиях клетки растут 3—5 нед, требуя в качестве ростового фактора только ИЛ-2. Однако после первых двух недель культивирования начинает обнаруживаться тенденция к снижению скорости роста. В этот момент клетки промывают и повторна
18—1278
274 Глава 16
стимулируют во вторичной СКЛ, культивируя по 105 Т-клеток в 2 мл среды RPMI—СПК в присутствии 106 облученных _МПК от того же донора. Обычно получают интенсивный вторичный ответ. Через 4 сут после повторной стимуляции клетки вновь переносят в среду GM.
Б. Клонирование аллореактивных Т-клеток
Т-клетки, повторно стимулированные во вторичной СКЛ и размноженные в среде GM в течение 1—2 нед, растут в суспензии, состоящей из отдельных клеток, и обладают жизнеспособностью, близкой к 100%. Клетки промывают, подсчитывают и клонируют способом лимитирующих разведений в лунках с V-образным дном 96-луночных микропанелей. Каждая лунка •содержит 3-104 облученных МПК (от того же, что и ранее, донора) в 200 мкл среды GM и в среднем по 1 или 0,2 Т-клетки. .Для предотвращения высыхания панели заворачивают в пластиковую пленку (Saran Wrap, Dow Chemical Co.) и инкубируют при 37 °С.
Приблизительно через 2 нед клоны в лунках, содержащих размножающиеся клетки (клоны по 104—105 Т-клеток), становятся хорошо заметными под микроскопом. Эффективность клонирования в различных опытах варьирует от 10 до 80%. Клетки из каждой положительной лунки переносят индивиду--ально в лунки 24-луночных панелей вместе с 5-105 облученных МПК, где они размножаются в среде GM до тех пор, пока не образуется количество клеток, достаточное для скрининга. Подобным образом клетки могут быть повторно клонированы при разведении 0,2 клетки на лунку.
