Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
На основании регрессивного анализа результатов экспериментов по культивированию возрастающих количеств клеток печени плода были охарактеризованы два условия роста. При таком анализе зависимость между числом помещаемых в культуру клеток и числом колоний, образующих зоны гемолиза, определяется как угол наклона линии регрессии, построенной по методу наименьших квадратов, на основании логарифма среднеарифметических значений, полученных в повторных опытах. Найденный после преобразований наклон, равный единице,
264 Глава 15
говорит о линейности и о том, что система лимитируется только клоногенными пре-В-клетками. Альтернативное объяснение, согласно которому лимитирующим компонентом являются вспомогательные клетки, находящиеся в соотношении 1:1с числом зарегистрированных зон гемолиза, было исключено в экспериментах по смешанному культивированию (Paige et al., 1985). Наклон > 2 свидетельствует о том, что систему лимитирует более чем 1 элемент и что происходящие взаимодействия относятся к реакциям высокого порядка.
2. Слой прикрепившихся клеток: наклон равен 1
Первоначально размножение предшественников В-клеток в агаре было получено на двухслойных культурах, выращенных поверх монослоя прикрепившихся клеток печени плода. -Слой прикрепившихся клеток получают, внося по 2-106 клеток в 1 мл жидкой культуральной среды в чашки Петри диаметром 35 мм (Falcon 1008). При использовании чашек, специально предназначенных для культивирования (Falcon 3005), требуется меньшее число клеток. После инкубации в течение 5 ч отсасывают среду и наслаивают нижний слой агара. Приблизительно 20% клеток, внесенных в культуру, остаются прикрепившимися к чашке Петри. После того как нижний слой агара застыл, на него наслаивают верхний слой, содержащий не-.фракционированную смесь клеток печени плода. Опыты по титрованию, в которых верхний слой агара содержал возрастающее число клеток печени плода, показали, что существует линейная зависимость между числом внесенных клеток и числом -образующихся антитело-секретирующих колоний. Эта зависимость сохраняется в интервале от 3-105 клеток/мл до таких концентраций клеток, которые дают меньше одной антитело-секретирующей колонии на чашку. Нижний предел концентраций зависит от частоты встречаемости предшественников В-клеток в печени плода, которая возрастает в процессе онтогенеза. Верхний предел обусловлен высокой частотой встречаемости миелоидных предшественников: слишком большое число таких клеток приводит к нарушению условий культивирования при высокой плотности засева. Оптимальное число засеваемых -клеток для получения 10—15 антитело-синтезирующих колоний на чашку составляет приблизительно 5-104 для 16-суточного плода, 1-105 для 15-суточного плода и 2—2,5-105 для 14-суточ-ного плода. При использовании печени 12- или 13-суточных ¦плодов нельзя получить такого числа колоний на чашку, и в этих случаях необходимо засевать большее число чашек ¦в каждом опыте. Более подробные сведения о частоте и абсолютном числе пре-В-клеток, способных образовывать колонии, были опубликованы ранее (Paige, 1983; Paige et al., 1984).
Дифференцировка предшественников В-клеток
265
Клетки печени 12—16-суточных плодов приблизительно эквивалентны в качестве источника эффективного слоя вспомогательных прикрепившихся клеток. Однако следует иметь ввиду, что при использовании более зрелых плодов увеличивается неспедифический фон вследствие неполной отмывки прикрепившихся клеток перед нанесением нижнего агарового слоя. Не-прикрепившиеся или плохо прикрепившиеся клетки попадают в агар нижнего слоя в момент его нанесения. Поскольку никакого физического барьера между нижним и верхним слоями агара не существует, те колониеобразующие клетки, которые достигают верхней поверхности нижнего слоя, иногда могут давать потомство, локализующееся в верхнем слое. Эти колонии нельзя отличить от потомства тех клеток, которые намеренно были внесены в верхний слой агара. Обычно мы оцениваем фон, обусловленный этим артефактом, анализируя культуры с «контрольным» верхним слоем агара, в который клетки печени плода не добавляли. При использовании клеток печени 12—15-суточных плодов этот фон достаточно низкий по сравнению с числом обнаруживаемых антитело-секретирующих колоний, и поэтому его просто вычитают. Однако на 16-е сутки этот фон существенно выше вследствие увеличения числа кле-ток-предшественников, присутствующих в печени плодов этого возраста. Простейший путь преодоления указанной трудности состоит в использовании прикрепляющихся клеток, не способных генерировать иммуноглобулин-секретирующие колонии, которые могут быть обнаружены при данной постановке опыта. Например, прикрепляющиеся клетки мышей CBA/N не образуют колоний, секретирующих антитела, и, следовательно, являются бесфоновым источником вспомогательных клеток. Альтернативный вариант состоит в использовании аллотип-специфиче-ских «проявляющих» реагентов, узнающих IgM-антитела мышей, несущих локус IgCHa'b-c, но не реагирующих с антителами, кодируемыми другими локусами (Griitzmann, 1981). Хотя обычно мы работаем с гистосовместимыми линиями, следует отметить, что при использовании гистонесовместимых комбинаций мы пока не получали каких-либо необычных — положительных или отрицательных — результатов.
