Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Глава 15
Дифференцировка предшественников В-клеток в полужидких агаровых культурах
К. Дж. Пэйдж, Е. Скарвалл, X. Саутер, С. Мэгазайни
I. ВВЕДЕНИЕ
Наши знания о процессах дифференцировки гемопоэтиче-ских клеток в значительной степени основаны на клональном анализе, который позволяет проследить потомство единственной клетки-предшественника. Этот анализ оказался полезным при изучении последовательности этапов дифференцировки в пределах клеточных линий, компартментации клеточных субпопуляций и роли растворимых медиаторов роста и дифференцировки. Впервые с помощью клонального анализа in vitro были обнаружены миелоидные предшественники, способные дифференцироваться в гранулоциты или макрофаги (Pluznik, Sachs 1965; Bradley, Metcalf, 1966). Впоследствии были разработаны варианты анализа, позволяющие обнаруживать предшественники эритроцитов (Stephenson et al., 1971; Axelrad et al., 1974), предшественники мегакариоцитов (Metcalf et al., 1975a), а также предшественники с менее ограниченным потенциалом, способные дифференцироваться при росте в полужидкой среде по нескольким направлениям (Johnson, Metcalf, 1977). Сходные методы использовали также и для разработки анализа клонального роста В-клеток (Metcalf et al., 1975 b, 1976; Kincade et al., 1976). Описаны методы клонирования В-клеток в жидкой среде с помощью лимитирующего разведения суспензии или микроманипулирования с клетками, а также на фрагментах селезенки (Klinman, 1972; Quintans, Lef-kovits, 1974; Andersson et al., 1977; Wetzel, Kettman, 1981). Применение этих методов для обнаружения и подсчета предшественников В-клеток встречало большие трудности, прежде всего в силу малочисленности соответствующих лимфоцитов в большинстве популяций. Несмотря на это, клональную диф-ференцировку В-клеток удалось проследить при использовании как лимитирующего разведения и культивирования клеток на фрагментах селезенки, так и полужидких агаровых культур (Melchers, 1977 a, b; Klinman et al., 1980; Paige, 1983, 1984; Paige et at., 1984; Jyonouchi, Kincade, 1983). В этой главе мы рассмотрим применение полужидких агаровых культур для из-
Дифференцировка предшествеиииков В-клеток
255
учения дифференцировки В-лимфоцитов. Система, которую мы использовали, позволяет обнаружить предшественники, которые присутствуют в печени 12-суточного плода, и обеспечивает возможность клональной дифференцировки этих клеток в колонии, содержащие В-лимфоциты, секретирующие антитела. Будет описан также способ обнаружения секретируемых антител либо с помощью локального гемолиза, либо посредством переноса продукта секреции на нитроцеллюлозные фильтры с последующей иммуноидентификацией. Далее, используя преимущества количественного анализа, которые дает эта система, мы сравним два варианта условий для роста культур. Первый обеспечивает линейное накопление зрелых клеток и, вероятно, имеет единственный лимитирующий фактор — число клеток-предшественников. Во втором варианте закономерности роста оказываются сложнее.
Методы культивирования в полужидкой среде основаны на ее высокой вязкости, что обеспечивает разъединенность внесенных в культуру клеток и, следовательно, дискретность развивающихся колоний. Растворимые компоненты легко диффундируют в полужидком носителе — матриксе и вследствие этого равномерно распределяются по всему объему культуры. Два главных преимущества клонирования клеток в полужидком агаре состоят в том, что с помощью этого метода легко проанализировать большое число клеток и легко визуализировать образующиеся клоны. Правда, недостаток всех методов клонального анализа — возможность случайного совмещения клонов, — разумеется, присущ и культивированию в полужидкой среде. Вероятные при этом ошибки оценивают в экспериментах по титрованию, которые позволяют установить «порядок» наблюдаемых событий. Для этого подбирают условия, при которых в ограниченном числе оказываются клетки только одного типа. Данные условия определяют по линейной зависимости между числом вносимых в культуру клеток и числом подсчитываемых событий (т. е. числом колоний). Таким образом были найдены условия как для роста sIg+B-клеток (Kincade, 1981 а, b), так и для роста предшественников В-клеток (Paige, 1983, 1984; Paige et al., 1984).
П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
При использовании метода агаровых культур в большинстве случаев раствор агара, содержащий диспергированные клетки, непосредственно заливают в культуральные чашки в один слой. После образования агарового полужидкого матрикса за ростом клеточных клонов внутри него можно следить обычным способом — с помощью стереомикроскопа. Вместе с тем иногда
256 Глава 15
предпочитают двойной слой агара, в частности при выделении прикрепляющихся перитонеальных макрофагов из культур клеток селезенки (Kurland et al., 1977). С помощью двойного слоя удается обеспечить рост колоний у поверхности агара (Kohler, 1979) или облегчить перенос интактных агаровых гелей на предметные стекла, где их проще обрабатывать для обнаружения секретируемых антител (Paige, Skarvall, 1982; Paige, 1982, 1983). Мы, например, при исследовании предшественников В-клеток использовали двухслойные агаровые культуры, так как преследовали цель отделить клетки-предшественники от прикрепленных к пластику клеток печени плода, которые часто используют в качестве источника ростовых факторов. Кроме того, двухслойные культуры позволяют безошибочно обнаруживать В-клеточный росток кроветворения по образованию зон гемолиза вокруг колоний в агаре (Paige, 1983, 1984; Paige et al., 1984). Приемы получения двухслойных и однослойных культур сходны. Использованная нами процедура в основных чертах не отличается от метода, описанного Кинкейдом (Kincade, 1981а, b), и представляет собой модификацию оригинального метода Меткалфа (Metcalf et al.,1975 b).
