Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
3. Ростовые факторы: наклон больше 1
Мы испробовали разнообразные ростовые факторы на их способность поддерживать дифференцировку колоний предшественников В-лимфоцитов, содержащих антитело-синтезирую-щие клетки. К настоящему времени нами обнаружено несколько таких факторов. К ним относятся: вырабатываемый клетками WEHI-3 ростовой фактор для нескольких линий гемопоэти-ческих клеток (мультилинеарный гемопоэтический ростовой
266 Глава 15
фактор, или, сокращенно МГРФ) (Iscove et al., 1982); вырабатываемый клетками L929 фактор, стимулирующий рост макро-фагальных колоний (или колониестимулирующий фактор 1, сокращенно КСФ-1) (Stanley, Heard, 1977); фактор, стимулирующий гранулоцитарные и макрофагальные колонии (ГМ-КСФ), который был получен из культуральной среды, кондиционированной клетками легкого мышей (Burgess et al., 1977). Во всех случаях, однако, стимуляция этими факторами образования антитело-синтезирующих колоний оказалась зависимой от первоначальной плотности клеток в культуре (Paige, 1984; Paige et al., 1984). Линия регрессии, построенная в логарифмическом масштабе и оптимально удовлетворяющая данным экспериментов по титрованию, имеет наклон, равный 2—3. Это согласуется с гипотезой о том, что образование колоний в этих культурах лимитирует более чем один тип клеток или более чем один клеточный продукт. Поскольку все упомянутые ростовые факторы обладают способностью стимулировать рост колоний, содержащих макрофаги, возможно, что в этих условиях в дополнение к колониеобразующим пре-В-клеткам лимитирующими факторами являются макрофаги или их продукты. Соображения о важной роли макрофагов в дифференцировке В-клеток уже высказывались ранее (Hoffman, 1980; Kincade et al., 1981 a, b; Giri et al., 1984).
4. Липополисахарид
Как правило, мы вносим в культуральную среду липополи-сахарид (ЛПС; 25 мкг/мл). Опыты, в которых ЛПС добавляли в среду с некоторой задержкой, показали, что он требуется для роста колоний только начиная с 4-х суток культивирования (при 8-суточном периоде культивирования). Этот результат, очевидно, указывает на то, что исходные клетки-предшественники в отличие от возникающих в культуре В-клеток, вероятно, нечувствительны к ЛПС. Такая интерпретация согласуется с ранее полученными данными (Melchers, 1977а).
III. КРАТКИЙ ПЕРЕЧЕНЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
А. Частота встречаемости
и абсолютное число клоногенных пре-В-клеток
в процессе онтогенеза
Используя методы, описанные в этой главе, предшественники В-клеток были выявлены в печени 12—-16-суточных плодов мышей. Ориентировочная частота встречаемости этих предшественников составляет: 3-10-6 на 12-е сутки, 12-Ю-6 на 13-е, 55-10-6 на 14-е, 125-10-6 на 15-е и 157* 10-6 на 16-е сутки. Абсолютное число клеток-предшественников составило по на-
Днфференцировка предшественников В-клеток
267
шим оценкам: 10 — на 12-е сутки, 100 — на 13-е, 1000 — на
14-е, 5000 — на 15-е и 6000 — на 16-е сутки (Paige, 1983, 1984; Paige et al., 1984).
Б. Временные характеристики процесса
образования зон гемолиза
Опыты по определению временных характеристик были поставлены на культурах клеток-предшественников, полученных от 12—16-суточных плодов. Ежедневно, со 2-х по 12-е сутки культивирования in vitro исследовали по несколько чашек. Мы обнаружили, что для клеток, взятых из 12—15-суточных плодов, пик образования зон гемолиза приходится на 8-е сутки культивирования. При использовании клеток печени от 16-суточных плодов наблюдали воспроизводимый сдвиг этого пика к 6-м суткам культивирования (Paige, 1983; Paige et al., 1984).
В. Фенотип клеточной поверхности
Мы исследовали поверхностные маркеры на предшественниках В-клеток, используя методику, в которой клетки, экспрессирующие данный антиген, связываются с пластиковой чашкой Петри, предварительно покрытой соответствующими моноклональными антителами (Wysocki, Sato, 1978). Из исследованных антигенов первым появляется антиген, распознаваемый моноклональными антителами АА4.1 (McKearn et al.,. 1984). Этот маркер был найден на 50% предшественников из печени 13-суточных плодов, на 80—90% клоногенных клеток из печени 14-суточных плодов и на 90% предшественников из печени 15- и 16-суточных плодов (Paige et al., 1984). Антиген В220, распознаваемый моноклональными антителами 14.8 (Kincade, 1981b), появлялся на 14-е сутки беременности (70%) и был представлен практически на всех предшественниках на
16-е сутки (95%). Антиген Lyb-2, распознаваемый моноклональными антителами 10. d. 1 (Subbarao, Mosier, 1983), впервые обнаружен только на 16-суточных предшественниках, причем 50% из них были антиген-положительными. В этих экспериментах нам не удалось обнаружить следующие антигены: (х,
I-А, I-Е и GF-1. Опираясь на эти результаты, можно выделить по крайней мере 4 подгруппы клоногенных пре-В-клеток: АА4-, В220-, Lyb-2-; АА4+, В220~, Lyb-2-; АА4+, В220+, Lyb-2”; и АА4+, В220+, Lyb-2+.
Литература
Anderssoti J., Coutinho A.. Lernhardt W„ Melchers F. (1977). Cell, 10, 27. Axelrad A. A., McLeod D. L„ Shreeve М. М., Heath D. S. (1974). In: Hemopoiesis
