Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 99

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 239 >> Следующая

Дифференцировка предшественников В-клеток
259
1 мл МСИДИ 2-106 клеток
ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА
5 ч.
373С.
5%С02
Удаляют жидкость: 1 мл МСИДИ.
содержащей 0,3% агара + ЛПС


НИЖНИЙ СЛОЙ
20 мин. комнатная температура
1 мл МСИДИ.
содержащей
0.3 % агара + ЛПС, и КСФ-1, ГМ-КСФ или мульти-ГРФ
I мл МСИДИ. ¦
- 100000300 с
содержащей
0,3 % агара + клетки
т г
ВЕРХНИЙ СЛОЙ
2—12сут. 37° С,
5% СО,
Рис. 15-1. Получение двухслойных культур.
ется большое число групп разных культур, но число чашек в каждой группе невелико, более удобен другой способ добавления растворенных веществ: внесение их в объеме, не превышающем 0,1 мл на чашку, после желатинизации нижнего слоя. Перед заливкой верхнего слоя агара культуральные чашки следует выдержать 20—25 мин при комнатной температуре.
2. Верхний слой агара
Для достижения конечного результата — получения полужидкого геля из 0,3%-ного агара, содержащего известное число диспергированных в нем клеток, — могут быть использованы различные способы. Выбор конкретного способа зависит как от замысла и масштабности опыта, так и от технических возможностей экспериментатора. Обычно среду разливают аликвотами по 10—50 мл и оставляют их при 37 °С в водяной бане. Расплавленный агар добавляют до конечного разведения
1 : 10. После смешивания среды и агара добавляют клетки, суспензию перемешивают и разливают по пластиковым чашкам Петри (диаметр 35 мм), содержащим нижний слой агара. Если готовят 50 чашек, содержащих идентичный верхний слой агара, то удобнее всего добавить необходимое число клеток к 50 мл содержащей агар среды, перемешать суспензию и разлить ее по чашкам. Если готовят 5 различных групп по 10 чашек, то лучше сначала внести клетки в пробирки на 15 мл
17*
260 Глава 15
(в объеме, меньшем чем 0,5 мл на пробирку), добавить в каждую пробирку по 10 мл содержащей агар среды, перемешать суспензию и разлить ее по чашкам. Имея опыт, этим способом можно успевать разлить по пробиркам 80—100 мл суспензии и избежать преждевременного застывания агара. Важно добавлять верхний слой агара достаточно медленно, чтобы не повредить нижний слой агара. Мы пробовали повышать концентрацию агара в нижнем слое, делая ее более 0,3%, но нашли, что это плохо сказывается на результатах.
Агару дают возможность застыть при комнатной температуре в течение 20—25 мин, после чего чашки помещают во влажную атмосферу, содержащую 5% С02.
Г. Обнаружение секретируемых антител
Во многих системах клонального анализа используют условия культивирования, способствующие селективному росту известного типа клеток-предшественников. Однако в условиях, оптимальных для предшественников В-клеток, прекрасно растут колонии многих других клеток. Для однозначной идентификации клеток, принадлежащих к В-клеточной линии диффе-ренцировки, мы используем методику, позволяющую оценивать секрецию антител клетками колоний в агаре. В день опыта верхний агаровый слой переносят на предметное стекло размером 60X30 мм. Для этого с помощью пастеровской пипетки вокруг края агаровой пластинки осторожно наносят 1—2 мл ЗФР. Разрыхленный гель осторожно сталкивают в ЗФР. В результате этой процедуры обычно происходит удаление только одного верхнего слоя агара. Всплывающий гель подхватывают на предметное стекло и покрывают квадратиком фильтровальной бумаги 40X40 мм (Whatman ЗММ, Clifton, NJ). Иногда слои агара не разделяются и оба попадают в ЗФР. В этих случаях их подхватывают предметным стеклом так, чтобы содержащий клетки слой оказался наверху. На верхний слой геля помещают квадратик сухой фильтровальной бумаги. Через несколько секунд фильтровальную бумагу осторожно стягивают за край. Верхний гель остается прилипшим к бумаге, в то время как нижний соскальзывает. В некоторых случаях этот процесс облегчается при потряхивании. Фильтровальную бумагу и верхний слой геля вновь помещают на предметное стекло для дальнейшей обработки. Предметные стекла укладывают на подставку, помещенную приблизительно в 50 см от тепловоздушной сушки, и здесь гели высыхают в течение 3— 6 мин. Гель считают высохшим в тот момент, когда фильтровальную бумагу удается снять без удаления какой-либо части агарового геля, который теперь оказывается прилипшим
Дифференцнровка предшественников В-клеток
261
ПЕРЕНОС ВЕРХНЕГО СЛОЯ НА ПРЕДМЕТНОЕ СТЕКЛО
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОН ГЕМОЛИЗА
п
Высушивание агарового геля теплым воздухом
50 мкл индикаторных клеток, 25 мкл антисыворотки,
25 мкл комплемента.
500 мкл 0,5%-ного агара в СР
ПЕРЕНОС НА НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫЙ ФИЛЬТР
5-6 ч, 37° С
Г оденет зон гемолиза, фиксация, окрашивание, подсчет колоний
НЦ-фильтр ?
1) Насыщение БСА
2) Выявление пятен с помощью антител, меченных ферментом
3) Подсчет пятен
фиксация, окрашивание, подсчет колоний
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed