Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
V. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
В силу сложности описанного метода некоторым его деталям должно быть уделено особое внимание. Так, очень важно, чтобы доноры костного мозга были не старше 4 нед. При получении культур прикрепившихся клеток костного мозга не следует отбрасывать клеточные агрегаты. В соответствии с опубликованными наблюдениями (Whitlock et al., 1984) мы обнаружили, что для оптимального развития функционально полноценных культур необходимо присутствие клеточных агрегатов, которые, вероятно, вносят существенный вклад в образование микроокружения. Рекомендуется предотвращать разрастание макрофагов, которые препятствуют созреванию предше-
252 Глава 14
ственников В-клеток. Это можно сделать, заменив МСИДИ на RPMI 1640 в момент добавления микроносителя Cytodex. Наконец, созреванию предшественников В-клеток способствует обрастание гранул Cytodex прикрепившимися клетками костного мозга. Вопрос о том, чем это обусловлено: тем ли, что стромальные вспомогательные клетки, растущие на микроносителях, имеют трехмерную организацию, или тем, что на слое микроносителей содержится большее число клеток, чем на пластиковой подложке, пока еще не решен.
Благодаря специфичности антител к определенному аллотипу иммуноглобулинов метод обратного локального гемолиза позволяет обнаруживать только В-клетки, возникающие из клеток-предшественников мышей BALB/c. Несмотря на это, мы все же исследовали вопрос о том, может ли популяция прикрепившихся клеток костного мозга C.AL20 вносить свой вклад в возникновение В-лимфоцитов. В эксперименте, проиллюстрированном на рис. 14-2, клетки-предшественники мышей
С. AL20 культивировали вместе с вспомогательными клетками мышей BALB/c и в обратной комбинации. После того как в пробах с неприкрепившимися клетками провели стимуляцию ЛПС, аликвоты суспензии клеток исследовали методом обратного пассивного локального гемолиза с использованием А-бел-ка и обратного локального гемолиза с использованием алло-тип-специфичных по отношению к BALB/c антител. Данные, представленные на рис. 14-2, ясно показывают, что фракция прикрепившихся клеток не вносит никакого вклада в пул зрелых В-клеток.
При приготовлении популяции предшественников В-клеток из костного мозга существует еще одна проблема. Если сравнить клетки, приготовленные с помощью различных методов, то можно видеть, что испытанные популяции различаются по количеству предшественников, способных созревать без микроокружения. Этот важный для метода аспект должен быть изучен в дальнейших исследованиях.
Литература
Andersson J., Coutinho A., Lernhardt W., Melchers F. (1977). Cell, 10, 27. Auerbach R. (1978). Dev. Comp. Immunol., 2, 219.
Benner R., Rijnbeek A. М., Schreier М., Coutinho A. (1981). J. Immunol., 126,
887.
Dexter Т. М., Lajtha L. G. (1974). Br. J. Haematol., 28, 525.
Dexter Т. M„ Testa N. G. (1980). J. Immunol. Methods, 38, 177.
Gisler R. N., Paige C. J., Hollander G. (1984). Immunobiology, 168, 441. Gronowicz E., Coutinho A., Melchers F. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 588. Griitzmann R. (1981). Ph. D. thesis, University of Cologne.
Houssaint E., Belo М., Le Douarin N. M. (1976). Dev. Biol., 53, 250.
Iscove N. N. (1984). In: Methods in Molecular and Cell Biology (D. Barnes,
D. Sirbasku, G. Sato, eds.), in press.
Создание клеточного микроокружения
253
Iscove N. N.. Melchers F. (1978). J. Exp. Med., 147, 923.
Jyonouchi H., Kincade P. W. (1983). J. Immunol., 130, 1616.
Kamps W. A., Cooper M. O. (1982). J. Immunol., 129, 526.
Kincade P. W. (1981). Adv. Immunol., 31, 177.
Kincade P. W., Lee G., Paige C. J., Scheid M. P. (1981). J. Immunol., 127, 255
Landreth K. S., Rosse C., Clageff J. (1981). J. Immunol., 127, 2027.
Lefkovits I., Waldmann II. (1979). Limiting Diluation Analysis of Cell in the Immune System, Cambridge Univ. Press, London — New York.
Molinaro G. A., Maron E., Dray S. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71, 1229.
Nossal G. J. V., Pike B. L. (1973). Immunology, 25, 33.
Osmond D. G. (1975). J. Reticuloendothel. Soc., 17, 97.
Osmond D. G., Everett N. B. (1964). Blood, 23, 1.
Osmond D. G„ Fahlman М. Т. E., Fulop G. М., Rahal D. M. (1981). In: Microenvironments in Haemopoietic and Lymphoid Differentiation (R. Porter, J. Whelan, eds.), p. 68, CIBA Foundation Symp. 84, Pitman, London.
Paige C. J. (1983). Nature, 302, 711.
Paige C. J., Kincade P. W., Moore M. A. S., Lee G. (1979). J. Exp. Med., 150, 548.
Paige C. J., Gisler R. H., McKearn J. P., Iscove N. N. (1984). Eur. J. Immunol, (in press).
Phillips R. A., Miller R. G. (1974). Nature (London), 251, 444.
Porter R., Whelan J. (1981). Microenvironments in Hemopoietic and Lymphoid Differentiation, CIBA Foundation Symposium No. 84. Pitman, London.
Rozing J., Brons N. H. C., Benner R. (1977). Cell Immunol., 31, 340.
Whitlock C. A., Witte O. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 3608.
Whitlock C. A., Robertson D., Witte O. (1984). J. Immunol. Methods, 67, 353.
Wysocki L. J., Sato V. L. (1978). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 2844.
