Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
386 Глава 17
Г. Отделение прикрепившихся клеток от подложки
Некоторые клоны ЦТЛ, особенно клоны третьего типа (разд. IV, Б, 3) довольно прочно прикрепляются к поверхности пластика. Такие прикрепившиеся клетки можно собрать после интенсивного пипетирования, однако эту процедуру выдерживают только около 50% клеток. Обычно мы используем более мягкий способ отделения клеток от подложки. Он состоит в том, что после отсасывания среды к культуре добавляют холодную среду, не содержащую Са2+ и Mgz+. Через 1 мин большую часть этой среды отсасывают и еще через 5 мин клетки суспендируют в свежей порции культуральной среды.
Д. Получение цитолитических Т-клеточных гибридом
Цитолитические гибриды получают гибридизацией клонов ЦТЛ мыши с клетками тимомы мышей или крыс (Nabholz et .al., 1980; Conzelmann et al., 1982a; Haas, Kisielow, 1984).
1. Селективные системы
Мы получаем цитолитические Т-клеточные гибридомы слиянием уабаин- и тиогуанинустойчивых (ГГФРТ-)-клеток тимомы BW5147 с клонами ЦТЛ. Гибриды отбирают в CS-среде, содержащей ГАТ, которая элиминирует ГГФРТ--опухолевые клетки, и в 10-3 М уабаине, убивающем ЦТЛ. Гибриды, отобранные в среде без ФРТК, оказались нецитолитическими (Nabholz et al., 1980). В других лабораториях используют различные линии опухолевых клеток и разные методы селекции (табл. 17-2).
1. Уабаин- и тиогуанинустойчивые ГГФРТ--клоны ЦТЛ тибридизуют с клетками тимомы AKR-A. Цитолитические гибриды отбирают в CS-среде, содержащей гАт и уабаин (Nabholz et al., 1980, 1982).
2. Тиогуанинустойчивые (ГГФРТ-) -клоны ЦТЛ гибридизу-ют с устойчивыми к бромдезоксиуридину (ТК-) клетками тимомы. Цитолитические гибриды отбирают в CS-среде, содержащей ГАТ (Nabholz et al., 1982).
3. Клоны ЦТЛ гибридизуют с уабаин- и 2,6-диаминопурин (ДАП)-устойчивыми АФРТ_-клетками тимомы. Гибриды отбирают в нормальной среде или CS-среде, содержащих уабаин и либо ААТ, либо АзА (Silva et al., 1983).
4. ЦТЛ из перитонеальной жидкости иммунизированных мышей или из первичной СКЛ гибридизуют с (ГГФРТ-) -клет-ками тимомы BW5147 (Kaufmann et al., 1981). Гибриды отбирают в среде, содержащей ГАТ, но в отсутствие ФРТК. В этих условиях выживают только гибриды, поскольку ЦТЛ не раз-
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
287-
Таблица 17-2. Линии опухолевых клеток’)
Опухолевые клетки ЦТЛ Селективная Источник данных
среда
BW5147 Клон третьего типа ГАТ+Уа Nabholz et al.,
1980, 1982
AKR-A Клон третьего типа ГАТ+Уа То же
(TGR, OuR)
MbC12 (Brd UR) Клон третьего типа ГАТ+Уа Nabholz et al.,
(TGR) 1982
BW5147 (TGR, OuR) Клон второго типа ГАТ+Уа To же
BW5147 (TGR, OuR) скл ГАТ+Уа »
BW5147 (TGR, OuR) СКЛ (или перитоне ГАТ Kaufmann et al.,
альные клетки) 1981, 1982a
W/Fu (C58NT), Клон третьего или ГАТ+Уа Conzelmann et al.,
D (TGR, OuR) второго типа 1982
W/Fu (C58NT), Второй тип ААТ+Уа Silva et al., 1983
D (DAPR, OuR) АзА+Уа
') Сокращения: TG ^ —тиогуанннустойчнвые; О и —уабаинустойчнвые; DAP^—
2,6-днамннопурннустойчивые; Brd U —бромдезоксиурндинустойчивые; СКЛ — смешанная культура лимфоцитов; ГАТ—гнпоксантин (10—4 М), амииоптерин (5-10—7 М) и тимидкн (1,6-10—5 М); ААТ — аденин (10—4 М), амнноптерин (5*I0~7 М) и тимндин (1,6*Ю~5 М); АзА — азасернн (2-10—Б М) и аденнн (10—4 М); Уа — уабанн; ЦТЛ — цнтотокснческие-лимфоциты.
множаются без ФРТК, а (ГГФРТ-) -опухолевые клетки не растут в среде ГАТ.
Получение вариантов клеточных линий, устойчивых к аналогам пуринов и пиримидинов и к уабаину, а также преимущества использования этих вариантов в деталях описаны ранее (Giles, Ruddle, 1973; Baker et al., 1974; Beezley, Ruddle, 1982; Choy et al., 1982; Morrow, 1982).
2. Слияние (гибридизация) клеток
Слияние клеток проводят в соответствии с методикой, описанной Гальфре и др. (Galfre et al., 1977). Для слияния используют культуры клонов, находящиеся в логарифмической фазе роста. Их промывают один раз СР и ресуспендируют в концентрации 2-10® клеток/мл. В пластиковой конической пробирке на 50 мл смешивают по 5 мл (107 клеток) суспензии каждой из родительских популяций клеток, добавляют ~40 мл СР и центрифугируют при 600 g 7 мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл СР, отбирают 100 мкл суспензии для контрольных культур (см. ниже), а оставшиеся клетки (18-106)
288 Глава 17
центрифугируют. Цель этого центрифугирования смеси родительских клеток двух типов в маленьком объеме среды состоит в том, чтобы получить осадок, в котором эти клетки хорошо перемешаны. Надосадочную жидкость полностью удаляют пастеровской пипеткой, а осадок помещают на несколько минут в водяную баню при 37 °С. В пробирку при осторожном ее покачивании по каплям прибавляют предварительно нагретый (37°С) 40%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ 4000). По каплям в течение 1 мин вносят 1 мл культуральной среды без сыворотки, 5 мл предварительно нагретой (37 °С) CS-среды, содержащей гипоксантин (Ю~4 М), тимидин (1,6-Ю-5 М), ан-тимикоплазменные антибиотики линкомицин (1 мг/мл) и тило-зин (100 мкг/мл), и 43 мл той же культуральной среды. Полученную смесь помещают в водяную баню при 37 °С. Через 45 мин гибридные клетки разливают в лунки пяти 96-луночных плоскодонных панелей по 3,6-104 клеток (включая мертвые) в 100 мкл на лунку. На одну панель приходится 2-106 контрольных негибридизованных клеток.
