Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Ж. Селективная среда
Для селекции гибридов используют CS-среду, содержащую гипоксантин (10-4 М), аминоптерин (4-10~7 М), тимидин (1,6Х ХЮ"5 М) и уабаин (10~3 М). Готовят следующие стократные исходные растворы.
284 Глава 17
а. Исходный раствор ГТ: 136,1 мг гипоксантина (Serva, номер по каталогу 26040, или Sigma, номер по каталогу Н-93771) и 37,8 мг тимидина (Sigma, номер по каталогу Т-9250) растворяют в 100 мл дистиллированной воды при 45—50 °С.
б. Исходный раствор А: 1,76 мг аминоптерина (Sigma, номер по каталогу А-2255) добавляют приблизительно к 90 мл дистиллированной воды. Для растворения аминоптерина добавляют 0,5 мл 1 н. NaOH и доводят объем дистиллированной водой до 100 мл. Затем раствор нейтрализуют, добавляя 0,5 мл
1 н. НС1. Аминоптерин предохраняют от света.
Исходные растворы ГТ и А фильтруют через фильтры с размером пор 0,2 мкм (Nalgene, Rochester, NY, США, тип фильтра LSCN 450-0020) и хранят в замороженном состоянии при •—20 °С в аликвотах по 1 мл.
Селективную среду готовят, добавляя 1 мл исходного раствора ГТ и 7,28 мг уабаина (Fluka Ag, Buchs SG, Швейцария) к 100 мл CS-среды. Уабаин растворяют при перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 1 мл исходного раствора А. Для того чтобы предотвратить заражение микоплазмой, обычно в среду вносят также 200 мкл линкомицина (50 мг/мл, Gibco Europe, номер по каталогу 043-5600) и 2 мл тилозина (5 мг/мл, Flow Laboratories, номер по каталогу 16-722-48).
III. МЕТОДЫ
А. Иммунизация in vivo
Сильная цитолитическая Т-клеточная реакция на антигены, отличные от антигенов главного комплекса гистосовместимости, обычно наблюдается в смешанных культурах лейкоцитов только после иммунизации in vivo. Для индукции ответа на слабый трансплантационный антиген HY, специфический для самцов, используют процедуру иммунизации, описанную в табл. 17-1. Для индукции in vivo цитотоксического ответа на клетки селезенки, конъюгированные с гаптеном, внутрибрю-шинно или внутривенно вводят мышам 107 таких клеток. Детали этой методики опубликованы (Haas, von Boehmer, 1984).
Б. Получение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ)
в массовых культурах
В первичной смешанной культуре лейкоцитов клетки селезенки или лимфатических узлов (107; табл. 17-1) кокультиви-руют с облученными рентгеном (2000 Р) клетками-стимуляторами (Ю7) из селезенки. Инкубацию проводят в 5 мл среды
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
285
Таблица 17-1. Иммунизация мышей in vivo для получения ЦТЛ против специфического трансплантационного антигена самцов
Происхожде Число Обработка имму Способ введения, Орган, уда- Щ , к
ние клеток клеток низирующих клеток суспензионная ляемый по- 03
среда1) сл? иммуни к «2 ИГ
зации S ч 5 ~
Ш с 2 tf
Селезенка 107 в/б; 0,2 МЛ ЗФР Селезенка 14
Селезенка ю7 --- п/к, подушечки » 14
лап; 50 мкл ЗФР
Селезенка 2-107 Рентгеновское об в/в; 0,2 мл ЗФР > 14
лучение (2000 Р)
Селезенка 2-107 То же п/к в хвост; 50 мкл Парааор- 7
ЗФР, 50 мкг кол- тальные
цемида лимфоузлы
') в/б— внутрнбрюшинно; п/к— подкожно; в/в — внутривенно.
в небольших пластиковых флаконах (Falcon 3024 F), расположенных вертикально в термостате на 37 °С во влажной атмосфере с 6% С02.
Повторно клетки стимулируют на 10—14-е сутки культивирования. Миллион выживших клеток культивируют с облученными рентгеном клетками-стимуляторами (107) из селезенки в 5 мл среды, как описано выше. Последующие повторные стимуляции проводят тем же способом через 7-суточные интервалы. В некоторых случаях в культуры добавляют частично очищенный фртк.
В. Выделение клонов ЦТЛ
После одной — пяти повторных стимуляций клетки клонируют методом микроманипуляций. Жизнеспособные клетки иа массовых культур очищают центрифугированием через слой фиколла (d = 1,090) и разбавляют суспензию до концентрации <103 клеток/мл. Отдельные клетки отбирают в оттянутые над. пламенем капилляры на 50 мкл (Richard-Allan, Medical Industries). Эти микрокапилляры изготавливают, пользуясь специальным приспособлением (F. S. Hockman, Scientific, Instruments 453, Media, PA). Отдельные клетки переносят в лунки плоскодонных панелей для микротитрования, содержащие по 106 облученных рентгеном клеток-стимуляторов и частично очищенный ФРТК в конечной концентрации 5%. Через 7—10 дней содержимое лунок, в которых наблюдают размножение клеток, переносят в культуры объемом 2 мл (Costar 3524), содержащие 107 облученных рентгеном клеток-стимуляторов в среде с частично очищенным ФРТК.
