Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
На первом этапе получения первичной культуры происходит стерильное удаление фрагмента ткани животного и его механическая или ферментативная дезагрегация. Ткань может быть просто измельчена до кусочков объемом около 1 мм3, которые прикрепляются к поверхности чашки благодаря собственной адгезивности, или наличию насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы [1]. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов и клетки, мигрирующие из эксплантатов, могут использоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) могут переноситься на новые чашки; мигрирующие клетки могут удаляться трипсинизацией, а остающийся эксплантат будет образовывать новые выросты. Трипсинизироваиные клетки пересеваются в новые сосуды и становятся вторичной культурой. По формальным признакам такая культура носит название линии клеток.
Первичные культуры могут быть также получены путем дезагрегации тканей ферментами, например трипсином (0,25%-ный неочищенный или 0,01—0,05%-ный очищенный) или кол-лагеназой (200—2000 ед./мл, неочищенная). Клетки образующейся при этом суспензии оседают, прикрепляются и распластываются на поверхности стекла или пластика [1]. Такой способ получения культуры обеспечивает более высокий выход клеток, хотя он кажется более селективным, поскольку только определенные клетки переживают диссоциацию. На практике успешное получение первичных культур из многих тканей, особенно из эпителия, связано с использованием коллагеназы; при этом размер эксплантата снижается до небольшого класте-
ра клеток, который затем прикрепляется к субстрату и разрастается [25]1.
Более подробно о методах получения первичных культур см. [1].
4.3.2. Субкультивирование
Монослойная культура может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения. В случае субкультивирования суспензионных культур достаточно только разведения. Диссоциация клеток монослойной культуры достигается лучше всего промыванием монослоя фосфатным солевым буфером (ФСБ) или ФСБ с 1мМ этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и последующей инкубацией с холодным раствором трипсина (0,25%-ный неочищенный или 0,01—0,05%-ный очищенный) в течение 30 с. После этого трипсин удаляется, клетки инкубируют дополнительно в течение 15 мин. Затем клетки суспендируют в среде, определяют их количество и рассевают на новые флаконы.
4.3.3. Кривая роста
После посева клеток во флакон они входят в лаг-период продолжительностью 2—24 ч, сменяющийся периодом экспоненциального роста (логарифмическая фаза). В конце этого периода клетки достигают плотного монослоя и входят в период медленного роста или покоя (фаза плато) (см. рис. 1.1). Эти фазы характерны для всех клеточных линий и позволяют получить воспроизводимые характеристики клеточных линий: продолжительность лаг-периода, время удвоения популяции в середине логарифмической фазы и насыщающую плотность клеток в монослое на фазе плато. Воспроизводимость этих характеристик возможна только при постоянстве условий культивирования.
Определение параметров ростового цикла весьма существенно для пассирования культуры и для проведения экспериментов на культурах. Поведение клеток и их биохимические свойства заметно различаются на разных фазах роста культуры, так что важно контролировать стадию ростового цикла, на которой в культуру добавляются различные препараты или реагенты или производится сбор клеток для пересева. Форма кривой роста позволяет также получить информацию о репродуктивном потенциале культуры (рис. 1.1). Не вызывает сомнения, что клональный анализ довольно прост и приводит к получению более однозначных и правильных выводов.
Проблемы роста и жизнеспособности клеток более подробно рассмотрены в гл. 8.
4.3.4. Замена среды
Некоторые быстроделящиеся культуры, например постоянные линии клеток, таких как HeLa, требуют смены среды после 3—4 сут культивирования. На необходимость смены среды обычно указывает значение pH ниже 7,0.
Кол-во нлеток/мл
2ХЮ5
1ХЮ5
2x10"*
1x10*
5Х103
Рис. 1.1. Гипотетические кривые роста для начальной концентрации клеток 104 клеток/мл. Из графика следует необходимость анализа всей кривой, а не подсчета клеток в одной временной точке.
4.3.5. Заражение культуры клеток
Опасность микробного заражения культур в значительной мере снижена благодаря использованию антибиотиков и ламинарных боксов. Однако следует по мере возможности избегать культивирования клеток с антибиотиками, поскольку проблема хронического латентного заражения все еще остается острой.
