Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Дифференцировка и пролиферация клеток регулируются (во многих случаях реципрокно) не только плотностью монослоя [8], но и питательными факторами среды (сыворотка, ионы Са2+) [5], гормонами [6], взаимодействием с внеклеточным матриксом [7]. Важно, таким образом, не только установить родословную используемых клеток, но и охарактеризовать и стабилизировать стадию их дифференцировки, подбирая плотность клеток, а также питательные и гормональные факторы для получения однородной клеточной популяции.
Динамические свойства культивируемых клеток часто трудно контролировать, и некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo, бывает трудно реконструировать in vitro. В связи с этим многие исследователи отказываются от идеи серийного размножения клеток in vitro, предпочитая использовать клеточные системы, сохраняющие структурную целостность исходной ткани. Такие системы, получившие название гистио-типических или органных культур, будут рассмотрены в гл. 7. Делались также попытки воссоздания тканеподобных структур in vitro путем реагрегации различных типов клеток и их культивирования при высокой плотности в форме сфероидов [9], перфузируемой многослойной культуры на пластиковом или стеклянном субстрате [10], или культивирования на микроносителях (коллагеновые волокна [11] или синтетические микропористые фильтры [12]).
2.2. Дифференцировка
Ведение клеточных линий требует постоянного увеличения числа клеток. Поэтому неудивительно, что продолжавшийся много лет выбор условий культивирования был направлен на обеспечение максимальной скорости клеточной пролиферации. Эти условия, как правило, оказывались неблагоприятными Для дифферендировки клеток, при которой их рост существенно ограничивается или полностью подавляется. К условиям, способствующим размножению, относятся низкая плотность клеток, низкая концентрация Са2+ [13] (100—600 мкМ) и присутствие ростовых факторов, таких как фактор роста эпидермиса (ФРЭ), фактор роста фибробластов (ФРФ) и фактор роста, синтезируемый тромбоцитами (ФРСТ). Высокая плотность клеток (выше 105 клеток/см2), высокие концентрации Са2+ (300—1500 мкМ) и присутствие индукторов дифференцировки (гормоны, например гидрокортизон [14], фактор созревания глии [15], фактор роста нервов [16], ретиноиды [17] и полярные растворители, такие как диметилсульфоксид [18]) способствуют прекращению клеточного деления и индуцируют дифференцировку клеток.
Роль сыворотки в дифференцировке до конца еще не выяснена, и действие ее зависит от типа клеток и состава используемой среды. Низкие концентрации сыворотки способствуют дифференцировке олигодендроцитов [19], но для дифференцировки бронхиального эпителия в ороговевающий используются высокие концентрации сыворотки [20]. В последнем случае активным началом оказываются молекулы сыворотки, близко родственные или идентичные фактору опухолевого роста р, выделяемому из тромбоцитов. Решению проблем, связанных с влиянием сыворотки на дифференцировку, несомненно будет способствовать использование химически определенных сред.
Большое значение, особенно для эпителия, имеет установление правильной полярности клеток и их формы. Во многих исследованиях было показано, что клетки, растущие на взвеси коллагенового геля, омываются питательной средой со всех сторон, и это позволяет устанавливать правильную полярность относительно базальной мембраны, а также поддерживать правильную форму клеток благодаря пластичности субстрата [21].
Итак, для размножения и дифференцировки клеток требуются различные условия культивирования. В ряде экспериментов требуется чередование фазы роста, результатом которой является наращивание клеточной массы, и фазы созревания, в которой клетки не растут, но в них экспрессируются те или иные признаки.
3. Выбор материала
Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках. Изучение таких общих клеточных процессов, как синтез ДНК, проницаемость мембран или определение цитотоксичности, может быть проведено на любых типах клеток. Исследование специализированных клеточных функций, таких как образование миотрубок, синтез антител или регуляция ферментов цикла мочевины, требует использования особых типов клеток, в которых происходит экспрессия этих функций.
3.1. Органная культура или культура клеток?
Исходно тканевыми культурами называли эксплантаты целых фрагментов тканей, полагая, что в этих фрагментах, по крайней мере частично, поддерживается гистологическая целостность. Теперь «культура ткани» превратилась в общее понятие, включающее в себя как органную культуру, в которой небольшие фрагменты ткани или целые эмбриональные органы эксплантируются с сохранением тканевой архитектуры, так и культуру клеток, когда ткани диспергируются механически, ферментативно или путем спонтанной миграции клеток из эксплантата, и клетки размножаются в виде суспензии или монослоя, прикрепившихся к субстрату клеток.
