Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Культуральные сосуды варьируют по размеру от многолуночных пластинок Тераски (площадь поверхности ~ 1 мм2, объем среды 5—10 мкл) и микротитровальных пластинок (~30 мм3/100—200 мкл) до набора чашек и флаконов с площадью поверхности до 180 см2 и вращающихся бутылей и мультиповерхностных пропагаторов для крупных культур (см. гл. 3). Определяющими факторами при выборе культуральной посуды являются требуемое количество клеток (максимальная плотность большинства трансформированных культур 5-104— 105 клеток/см2), требуемое количество параллелей (96 для микротитровальной пластинки) и порядок отбора образцов. 24-луночные чашки достаточно хороши для большого количества параллелей при одновременном отборе образцов, но когда отбор образцов производится в разное время, предпочтительнее использовать индивидуальные флаконы или бутыли. Чашки Петри дешевле флаконов и достаточно удобны для последующих обработок клеток, например при окрашивании или экстракции. Флаконы могут быть герметично закрыты; при этом пе требуется инкубатора с продувкой С02; кроме того, при использовании флаконов снижается опасность заражения культур.
В случае суспензионных культур главным определяющим фактором является объем сосуда. При увеличении объема могут создаваться проблемы в перемешивании и аэрации культур (см. гл. 3).
4. Подготовка
4.1. Субстрат
Во многих лабораториях в настоящее время для культур тканей используется пластмассовая посуда одноразового применения. Эти сосуды оптически прозрачны и подготовлены для использования в культивировании тканей путем модификации пластика, увеличивающей его смачиваемость и облегчающей прикрепление клеток. Некоторые культуральные сосуды выпускаются в стерилизованном виде. В целом пластмассовую посуду удобно применять и в процессе наращивания клеток, и для решения экспериментальных задач. В то же время одноразовая культуральная посуда является дорогой.
4.1.1. Мытье стеклянной культуральной посуды
Для пассирования постоянных и многих ограниченных линий клеток вполне подходит стеклянная культуральная посуда при условии, что вы обладаете отделением для мытья посуды
и возможностью контроля качества чистой посуды. Следует использовать нетоксичные детергенты. Посуда должна выдерживаться в растворе детергента предпочтительно в течение ночи и после этого тщательно промываться проточной и затем деионизованной или дистиллированной водой. Важно, чтобы вся стеклянная посуда, указанная в последующих главах, соответствовала или превосходила указанную спецификацию.
4.1.2. Стерилизация стеклянной посуды
Пластиковая посуда поступает в стерильном виде, а стеклянная культуральная посуда перед употреблением должна быть простерилизована. Все прописи, приведенные в последующих главах, предусматривают использование стерильной стеклянной посуды. Во многих лабораториях проводится массовая стерилизация всей посуды независимо от ее непосредственного использования для культивирования. Это исключает возможность ошибки в выборе посуды из стерильных и нестирильных источников.
Стерилизацию лучше всего проводить в сухожаровом стерилизаторе (160°С в течение 1 ч), помещая посуду в контейнеры или заворачивая в фольгу. Завинчивающиеся крышки сосудов автоклавируются отдельно.
Качество посуды, процесс ее мытья и выбор детергента следует периодически проверять. Для этого лучше всего промыть посуду обычным образом, оценить чистоту на глаз, высушить, простерилизовать и использовать для клонирования клеток в монослое (гл. 4 и 8) предпочтительно при низкой концентрации сыворотки (2—5%) или в ее отсутствие (см. гл. 2).
4.2. Среда
Большинство обычно используемых сред поставляется производственными предприятиями, но среды специального состава (см. гл. 4) или добавки к ним приходится готовить и стерилизовать самостоятельно. Как правило, стабильные растворы (вода, солевые растворы и такие добавки к средам, как трипто-за и пептон) стерилизуются автоклавированием (121 °С при
1 атм избыточного давления). Нестабильные растворы (полная среда, трипсин, сыворотка) стерилизуются фильтрованием через мембраны с диаметром пор 0,2 мкм (фирмы Millipore, Sa’r-torius, Gelman, Pall).
При использовании автоматизированных автоклавов нужно следить, чтобы продолжительность цикла определялась температурой загруженного материала, а не величиной давления или температурой камеры или теплоносителя, которые увеличивают-
ся с большей скоростью, чем температура автоклавируемого материала.
Проверка стерильности (см. гл. 4) должна проводиться для каждого фильтрованного образца.
4.3. Клетки
4.3.1. Первичная культура
Первичной называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого пересева. Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro. Далее, при пролиферации культивируемых клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимпся или медленно делящимися клетками. Поэтому на этой стадии может оказаться необходимым проведение отбора специфических типов клеток путем клонирования, селективного культивирования (гл. 2) или физического разделения клеток (гл. 5 и 6).
