Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Довести pH до 7,0
Метаиол 10%-ная ТХУ
3.3. Реагенты для гибридизации
Раствор каучука (Cow Proofings Ltd., Slough, Berks)
Буфер
Зонд
Довести до рабочей консистенции с помощью около 1/10 объема петролейного эфира с точкой кипения 60—80 °С
Трехкратный стандартный солевой цитратный раствор, содержащий 40% формамида (Fluca), pH 6,5
Растворите меченую нуклеиновую кислоту в буфере до конечной радиоактивности 5-107 рас-пад./мин/мл.
Прн использовании двунитевой кислоты денатурируйте при 70 °С непосредственно перед использованием
3.4. Радиоавтография
Пленка Кодак AR-10 Жидкая эмульсии Илфорд K-5D или L4
Проявитель Кодак D-19 Фиксатор Илфорд Типам с дубителем
Фосфатный буфер Соренсена 67 мМ
pH 6,9 КН2РО,
Na2HP04
Дистиллированнаи pH 5,75 КН2РО,
Na2HPO*
Дистиллированная
Нейтральная смола для заливки DPX (R. A. Lamb)
Краситель Мэй-Грюнвальда (Gurr)
Краситель Гимза (Gurr)
Гематоксилин (Gurr)
Тартразии (Gurr)
4. Подробный протокол. Гибридизация in situ
Выявление клеточных транскриптов РНК методом гибридизации легко осуществимо и не требует использования зондов с высокой удельной активностью или усиления сигнала. Применяя пропись, представленную ниже, можно добиться успешной гибридизации.
4.1. Гибридизация in situ
I. Монослойные культуры можно выращивать на покровных стеклах или подложках из Терманокса (Lux, Flow Laboratories). Цитологические препараты суспензионных культур могут быть приготовлены центрифугированием клеток и помещением их на покрытые желатином предметные стекла (Shandon, Cytocentrifuge or Damon/IEC Cytobu-
4,53 г 5,93 г вода 1 л
0,89 г 8,38 г вода 1 л
Рис. 9.1. Гнбрнднзация кДНК глобина крыс с периферическими клетками крови анемичных крыс (70% ретикулоцнтов по данным суправитального окрашивания). Зонд гнбриднзуется с большинством безъядерных клеток, тогда как лимфоциты и 28% безъядерных клеток остаются немеченнымн. Для гибридизации использовалась комплементарная ДНК глобина крыс (получена Эльке Корге; удельная активность 15-106 импульс/мин на 1 мкг). Гибридизация в стандартном солевом растворе тройной крепости с 40% формамида при 43 °С в течение 18 ч. Постгибридизационная обработка: 0,5 ч в стандартном солевом растворе двойной крепости при 55 °С. Выявление гибридов: радиоавтография на пленке Кодак AR-10, 4-недельная экспозиция, проявитель Кодак D19, разведенный равным объемом воды; фиксатор Илфорд Типам; окраска 25 мин Мэй-Грюнвальд и 25 мин Гимза. Микрофотография иа плеику Илфорд Паи F 35 мм.
ckets). Могут быть также использованы тонкие криостат-ные срезы тканей или клеточных осадков.
II. Зафиксируйте препараты в течение 5 мин в метаноле, после чего трижды промойте 10%-ной ТХУ при 4°С.
III. Поместите в 70%-ный этанол и затем высушите на воздухе. Покровные стекла следует приклеить к предметным стеклам клетками вверх, используя DPX. Эти образцы в Случае необходимости можно хранить при 4°С в течение нескольких недель.
IV. Перенесите 5 мкл раствора с меченым зондом непосредственно на фиксированные клетки, предварительно прогретые до 43°С (для этого поместите стекла на металличе-
скую поверхность, под которой циркулирует вода при 43 °С).
V. Покройте каплю покровным стеклом диаметром 16 мм.
VI. Заклейте края покровного стекла раствором каучука.
VII. После высыхания проверьте визуально качество заклейки и инкубируйте стекла в течение 18 ч на плоской металлической пластинке при 43°С в водяной бане с крышкой. Высокая влажность будет полезна, если непрочно приклеить покровные стекла.
VIII. В конце периода инкубации охладите препараты на льду и отделите пинцетом резиновую заклейку от покровного стекла.
IX. Удалите покровное стекло под поверхностью двукратного стандартного солевого цитратного раствора или смойте покровное стекло струей этого раствора.
X. Заложите предметные стекла в держатель и опустите в стеклянную кювету с двукратным цитратным раствором. Заклейте крышку липкой лентой.
XI. Частично погрузите кювету в водяную баню при 55°С на 30 мин.
XII. Промойте стекла двукратным стандартным солевым цитратным раствором (18°С) 4 раза.
XIII. Проведите для обезвоживания через серию спиртов вплоть до абсолютного этанола и высушите на воздухе.
XIV. Выявите гибриды радиоавтографией, используя пленку или жидкую эмульсию.
Условия гибридизации и последующая тепловая обработка должны обеспечивать достаточную строгость связывания, позволяющую избежать неспецифического связывания меченого зонда.
5. Радиоавтография
Фотографическая эмульсия может быть нанесена на стекло с клетками либо путем наложения полоски с эмульсией на основе желатина, либо погружением стекла в жидкую эмульсию.
Снимающаяся пленка Кодак AR-10 (Kodak) представляет собой преформированный слой желатина, нанесенный на стеклянную подложку. Для проведения радиоавтографии пленка легко отделяется от стекла при безопасном красном освещении. Такая пленка обеспечивает только один размер кристаллов и, следовательно, только один уровень чувствительности. Составляющий основу пленки желатин делает окраску клеток после радиоавтографических процедур несколько более сложной, чем при использовании жидких эмульсий.
