Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
выявления таких зондов после гибридизации можно использовать два метода: (а) иммунологический, с применением
антител к биотину и последующим нанесением вторых антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, ферментом или электроноплотным реагентом, и (б) аффинное мечение, использующее преформированные комплексы родамина, конъюгированного с авидином, или авидина с биотинилированными производными пероксидазы или щелочной фосфатазы. Биотини-лированный dUTP для использования в ник-трансляции в комплекте с авидином и биотинилированной щелочной фосфатазой в качестве системы обнаружения ДНК поставляется фирмой Bethesda Research Laboratories.
7. Благодарности
Экспериментальные исследования, описанные в этой главе, обеспечивались субсидией Компании раковых исследований.
Литература
1. Gillespie D., Spiegelman S. (1965). J. Mol. Biol., 12, 829.
2. John H. A., Birnstiel M. L., Jones K. W. (1969). Nature, 223, 582.
3. Gall J. C„ Pardue M. L. (1969). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63, 378.
4. Harrison P. R., Conkie D., Paul J., Jones K. (1973). FEBS Lett., 32, 109.
5. Conkie D., Affara N., Harrison P. R., Paul J., Jones K. (1974). J. Cell Biol., 63, 414.
6. Attenburg L. C., Getz M. JCrain W. R., Saunders G. F„ Shaw M. \V. (1973). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 1536.
7. Wolgemuth D. J., Jagello G. М., Atwood К. C., Henderson A. S. (1976). Cyto-genet. Cell Genet., 17, 137.
8. Hafen E., Levine М., Garber R. L., Gehring W. J. (1983). EMBO J., 2, 617.
9. Birnie G. D., Burns J. H., Clark P., Warnock A. M. (1984). J. R. Soc. Med., 77, 289.
10. Singer R. H., Ward D. C. (1982). Proc. Natl. Sci. USA, 79, 7331.
11. Wahl G. М., Stern М., Stark G. R. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3683.
12. Rigby P. W. J., Dieckmann М., Rhodes C., Berg P. (1977). J. Mol. Biol., 113 237.
13. Tereba A., Lai М. М. C., Murti К- C. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 6486.
14. Szabo P., Ward D. C. (1982). Trends Biochetn, Aci., 7, 425.
15. Rogers A. W. (1979). Partical autoradiography, available as Review 20 from
Amersham International.
16. Levinson J. W., Desostoa A., Liebes L. F., McCormick J. J. (1976). Biochim. Biophys. Acta, 447, 260.
17. Rudkin G„ St oiler B. (1977). Nature, 265, 472.
18. Manning J. E., Hershey N. D., Broker T. R., Pellegrini M.: Mitchell H. K., Davidson N. (1975). Chromosoma, 53, 107.
19. Cheung S. W., Tishler P. V., Atkins L„ Sengupta S. K-, Modest E. J., For-
. get B. G. (1977). Cell Biol. Intl. Rep., 1, 255.
20. Langer P. R.. Waldrop A. A., Ward D. C. (1981). Proc. Natl. Acad Sci.
USA, 78, 6633.
21. Langer-Safer P. R., Levine М., Ward D. C. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4381.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Общи* рмгенты
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный)
СаС12
КС1
КН2Р04
MgCl2X6H20
MgS04X7H20
NaCl
Na2HP04X7H20 Феноловый красный Вода до
0,14 г (1,26 мМ)
0,40 г (5,36 мМ)
0,06 г (0,44 мМ)
0,10 г (0,49 мМ)
0,10 г (0,41 мМ)
8,00 г (0,137 М)
0,09 г (0,34 мМ)
0,01 г
1000 мл
Автоклавировать при pH ниже 6,5 (давление ~ 1 атм) 20 мин. Перед использованием довести pH до 7,4 стерильным NaOH. Можно использовать в качестве буфера стерильный 1 М HEPES, разводимый до 20 мМ.
При необходимости добавления глюкозы ее следует автоклавировать отдельно в концентрации 100 г/л и при добавлении разбавлять до концентрации 1 г/л (5,55-10_3 М).
Приготовленный по этой прописи раствор применяется для общих работ, промывания и препарирования. При использовании в качестве основы для ростовых сред в него следует добавлять глюкозу (см. выше) и ЫаНСОз в концентрации 0,35 г/л (4 мМ). В таком виде он пригоден для культивирования в закрытых сосудах с воздухом в качестве газовой фазы.
Фосфатный солевой буфер в модификации Дюльбекко, раствор А (ФСБА без Са2+ и Mg2+)
КС1 0,20 г (2,68 мМ)
• КН2Р04 0,20 г (1,47 мМ)
NaCl 8,00 г (0,137 М)
Na2HP04X7H20 2,16 г (8,06 мМ)
Вода до 1000 г
Стерилизовать автоклавированием (давление «1 атм) 20 мин. Использовать для промывания перед дезагрегацией и для разведения трипсина.
Сбалансированный солевой раствор для препарирования
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса или ФСБА с пенициллином (250 ед/мл), стрептомицином (250 мкг/мл), кана-мицином (100 мкг/мл) или гентамицином (50 мкг/мл) и фунги-зоном (2,5 мкг/мл).
ФСБА/ЭДТА
1^а2ЭДТА 0,372 г (1 мМ)
ФСБА до 1000 мл
Стерилизовать автоклавированием при 1 атм 20 мин.
Трипсин
2,5 г (грубый Дифко 1/250) или 0,1 г (трижды перекристал-лизованный, Sigma).
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса или ФСБА или ФСБА/ЭДТА до 1000 мл, как потребуется для получения полной дезагрегации.
