Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
1.2. Преимущества гибридизации in situ
Обычная техника гибридизации in vitro обеспечивает получение усредненных показателей для ткани-мишени в целом. Это затрудняет интерпретацию результатов, полученных на смешанной популяции клеток разных типов, или на популяции клеток одного типа, неоднородных, например, по стадии дифференцировки, или по положению в клеточном цикле при асинхронной пролиферации, или по другим показателям. Техника гибридизации in situ позволяет в известном смысле преодолеть эти проблемы, поскольку полученные результаты относятся к индивидуальной клетке и даже к индивидуальной хромосоме. Комбинация гибридизации с цитологическим исследованием позволяет получить дополнительную информацию о локализации молекулярного гибрида в той или иной структуре ткани-мишени. И наконец, этот метод пригоден для анализа небольшого числа клеток.
2. Основные требования
Эффективность гибридизации in situ зависит от следующих параметров: (I) частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей-мишеней (т. е. числа специфических последовательностей нуклеиновой кислоты, присутствующих в цитологическом препарате); (II) чистоты зонда; (III) удельной радиоактивности меченого зонда; (IV) чувствительности метода гибридизации; (V) усиления сигнала; (VI) эффективности метода радиоавтографического выявления пробы.
2.1. Избыточность последовательности
Первоначально метод гибридизации in situ был наиболее успешно применен для выявления нуклеиновых кислот, находящихся в клетках в большом количестве копий. Этим методом выявляли, например, повторяющиеся последовательности сател-литных ДНК, амплифицированные рибосомальные ДНК в ооци-тах амфибий, латерально амплифицированные ДНК в политен-ных хромосомах двукрылых, рибосомальную и 5S РНК. Более того, с помощью этой же техники были идентифицированы и локализованы накапливающиеся в клетках транскрипты генов.
В то же время, последовательности генов, присутствующие в клетках млекопитающих в виде одной копии, были достоверно локализованы в определенных участках генома только недавно. Этого удалось достигнуть благодаря использованию зондов с высокой удельной активностью и развитию методов усиления сигнала.
2.2. Чистота зондов
Результаты молекулярной гибридизации in situ могут быть достоверными только при условии высокой чистоты зондов; поскольку метод основан на использовании избытка зонда, даже малейшие примеси могут принимать участие в гибридизации. Используя стандартные физические методы, можно получить зонды высокой чистоты для нуклеиновых кислот, имеющихся в избытке, таких как рибосомальная РНК. Однако относительно низкая концентрация большинства видов мРНК создает значительные трудности при использовании этих методов для получения зондов в чистом виде и в достаточном количестве. Проблема примесных последовательностей нуклеиновых кислот решается благодаря применению методов клонирования рекомбинантных ДНК; в принципе эти методы могут быть использованы для получения зондов на любые интересующие вас гены или участки генома.
2.3. Удельная активность зондов
Удельная радиоактивность зондов должна быть достаточно высокой, чтобы обеспечить их выявление после гибридизации при разумном времени экспозиции радиоавтографов и при высоком отношении сигнал/шум. Экзогенными нуклеиновыми зондами могут быть РНК или ДНК, комплементарные к анализируемым клеточным последовательностям. Радиоактивные зонды могут быть получены путем транскрипции in vitro с РНК-по-лимеразой, обратной транскриптазой или ник-трансляции в присутствии предшественников, меченных 35S или 3Н. Коммерческие наборы РНК-полимеразы, ник-трансляции или обратной транскриптазы, содержащие все необходимые реагенты и подробные протоколы для получения меченных изотопами зондов РНК или ДНК, поставляются фирмами Amersham International pic или New England Nuclear Division of DuPont. Возможно также пометить нуклеиновые кислоты 1251. При мечении идентичных зондов РНК 3Н и 1251 получаются качественно идентичные картины распределения зерен серебра на радиоавтографах при гибридизации in situ [6]; иодированная рибосомальная РНК позволяет получить корреляцию числа зерен при гибридизации с клетками в мейозе в зависимости от содержания ДНК [7].
Можно посчитать, что при обычной гибридизации in situ с использованием меченного тритием зонда с удельной радиоактивностью 10® распад./мин на 1 мкг уникальный ген размерами около 103 пар оснований обеспечит образование одного зерна серебра на автографе после 100 дней экспозиции. Это. безусловно, слишком долгий срок, неприемлемый еще и из-за неблагоприятного отношения сигнал/шум в этих условиях.
При использовании в качестве предшественника одного из нуклеотидов, меченного 35S, можно получить зонды с удельной радиоактивностью 109 распад./мин на 1 мкг в системе с обратной транскриптазой или 3• 10s распад./мин на 1 мкг в системе ник-трансляции. Эти удельные активности пропорционально увеличиваются при использовании двух или трех меченых предшественников, но, когда используются все четыре предшественника, меченные 35S, происходит снижение активности обратной транскриптазы и системы ник-трансляции. При ник-трансляции с использованием 1251-дезоксицитидина (уд. активность выше 1500 Ки/моль; Amersham или NEN) без носителя удается в настоящее время получить зонды с удельной активностью 109 распад./мин на 1 мкг и выше.
