Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 126

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 120 121 122 123 124 125 < 126 > 127 128 129 130 131 132 .. 136 >> Следующая

При втором способе ядерная эмульсия расплавляется в водяной бане. Эмульсия Илфорд K-D5, не требующая разведения, может быть использована при желто-коричневом безопасном
свете. Предметные стекла погружают в эмульсию, образующую тонкую пленку над образцом. Радиоавтографы относительно легко красить, поскольку желатин эмульсии образует очень тонкий слой. Чувствительность метода при использовании эмульсий широко варьирует, так как образуются зерна серебра разных размеров. При таком способе, впрочем, труднее обеспечить постоянную толщину слоя эмульсии, чем при использовании пре-формированных пленок.
5.1. Радиоавтография с пленкой Кодак AR-10
I. Разрежьте пленку AR-10 скальпелем на полоски размером приблизительно 40x25 мм.
II. Отделите полоски от стеклянной подложки и поместите их на поверхность дистиллированной воды при 26°С на 3 мин слоем эмульсии вниз, чтобы эмульсия в воде набухла.
III. Предметные стекла с препаратами подведите в воде под пленку эмульсии. Поднимите стекло таким образом, чтобы пленка оказалась в тесном контакте с препаратом и свешивалась с краев стекла.
IV. После высушивания на воздухе экспонируйте пленку при 4°С в светонепроницаемой коробке с силикагелем.
V. После экспозиции проявите пленку, погружая стекла при 18 °С на 5 мин в проявитель Кодак D19, разведенный в 2 раза дистиллированной водой.
VI. Не промывая, зафиксируйте автографы, погружая их при 18°С на 3 мин в фиксатор Илфорд Типам, содержащий кислый дубитель.
VII. Промойте проточной водой и поместите на 2 мин в промывающий агент Гипо (Kodak).
VIII. Осторожно промойте 5 мин холодной проточной водой при 10—18 °С и высушите на воздухе.
5.2. Окрашивание радиоавтографов с пленкой
I. Окрасьте автографы красителем Мэй-Грюнвальд вдвое
разбавленным 67 мМ фосфатным буфером Соренсена pH 5 ,75 в течение 25 мин при 18 °С. Для предотвращения отложения осадка, который может образовываться вследствие постепенного окисления красителя, предметные стекла погружайте и окрашивайте в вертикальном положении. Во избежание загрязнений препаратов окисленной пеной, образующейся на поверхности раствора красителя, не следует вынимать стекла вплоть до конца окрашивания. По окончании окраски имеет смысл заполнить кювету с красителем избытком буфера при 18°С, чтобы пена стекла через края кюветы.
II. Выньте стекла и окрасьте их в 5%-ном красителе Гимза (Gurr) в буфере pH 5,75 в течение 25 мин при 18°С. Следует предпринимать те же предосторожности, что и при предыдущем окрашивании.
III. Осторожно промойте стекла в холодной воде, высушите и заключите в смолу DPX.
IV. Можно также окрасить автограф в гематоксилине в течение 2 мин и затем 15 мин промыть медленно текущей холодной проточной водой при 10—18°С. Затем автографы следует отдифференцировать в тартразине в течение 5 мин, промыть, высушить и заключить в DPX.
5.3. Радиоавтография с жидкой эмульсией
(См. также гл. 7.)
I. Покройте стекла эмульсией, расплавленной при 50°С и разбавленной в 3 раза дистиллированной водой при 50°С (если это рекомендуется инструкцией производителя эмульсии).
II. Дайте стечь эмульсии и сотрите ее с обратной стороны стекла.
III. Высушите на воздухе и поместите в светонепроницаемый ящик при 4°С. Во избежание быстрого обезвоживания тонкого слоя эмульсии и последующего растрескивания рекомендуется вносить в ящик силикагель, но не ранее чем через 24 ч. Экспонируйте препараты в течение необходимого времени.
IV. Обработайте радиоавтографы, как указывалось выше.
5.4. Окраска радиоавтографов, покрытых жидкой эмульсией
I. Окрасьте 15 мин в красителе Мэй-Грюнвальд, разбавленном в три раза буфером Соренсена pH 6,9 при 18 °С.
II. Промойте буфером и окрасьте в 5%-ном красителе Гимза pH 6,9 при 18 °С в течение 15 мин. Следует придерживаться методик, позволяющих избежать неспецифического отложения красителей.
III. Осторожно промойте в холодной воде, высушите на воздухе и заключите в смолу DPX.
IV. Можно также окрашивать гематоксилином и тартразином, как указывалось выше.
Более подробную информацию о радиоавтографии можно
получить в обзоре, предоставляемом Amersham International [15].
6. Выявление молекулярных гибридов нв цитологических препаратах с помощью методов, не использующих радиовктивную метку
Другие методы выявления гибридизуемых in situ клеточных транскриптов с использованием флуоресцентных или конъюгированных с ферментом зондов обладают рядом преимуществ по сравнению с обычной процедурой радиоавтографического выявления. Эти преимущества заключаются в следующем: (I) резко сокращается время, необходимое для определения участка гибридизации из-за отсутствия периода экспозиции радиоавтографов; (II) методы выявления флуоресценции обеспечивают более высокое разрешение, чем при использовании радиоавтографов; (III) при отказе от радиоавтографии часто удается увеличить отношение сигнал/шум.
Простейший из этих методов выявления использует в качестве зондов частично апуринизированные ДНК в комплексе с акрифлавином [16]. Последний может быть выявлен по флуоресценции после гибридизации in situ. Рудкин и Столлар [17] предложили использовать специфическую иммунную сыворотку кроликов против двунитевых гибридов ДНК/РНК, образующих комплекс с метилированным БСА. Эти комплексы затем выявляли in situ с помощью конъюгированных с родамином антител к кроличьим иммуноглобулинам G. Мэнинг с сотрудниками [18] предложили новую систему обнаружения, использующую биотин, ковалентно связанный с зондами нуклеиновых кислот. Участки гибридизации, содержащие биотинилированную РНК, метили полиметакрилатным латексом, ковалентно связанным с авиди-ном, который обладает высоким сродством к биотину. Частицы латекса затем выявляли сканирующей электронной микроскопией; чувствительность метода оказывалась пропорциональной количеству частиц, связанных в участке гибридизации нуклеиновых кислот. Более чувствительная система была предложена Ченгом с сотрудниками [19], использовавшими интенсивно флуоресцирующие частицы латекса, конъюгированные с полиу-ридиловой кислотой. Перед гибридизацией in situ их отжигали с З'-концами комплементарных РНК, используемых в качестве зондов. Выявление образующихся двойных гибридов проводилось с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. Позднее Лангер с сотрудниками [20] синтезировали аналоги дезокси-уридин-. или уридинтрифосфата, содержащего биотин, ковалентно пришитый в положение С-5 пиримидинового кольца через «лин-керные» аллиламиновые группы. Биотинилированные аналоги дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) могли затем включаться в зонды ДНК путем ник-трансляции. Использование таких полинуклеотидов при гибридизации in situ обеспечивало более высокое разрешение и лучшее отношение сигнал/шум [21]. Для
Предыдущая << 1 .. 120 121 122 123 124 125 < 126 > 127 128 129 130 131 132 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed