Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
(O2 ), предохраняя таким образом от их повреждающего действия
липосодержащие биоструктуры. И хотя эффективность церулоплазмина в отношении связывания супероксиданиона оценивают примерно в 100 раз ниже, чем у СОД, в настоящее время он рассматривается в качестве основного антиоксиданта плазмы крови. Как белок церулоплазмин обладает высокой стабильностью к токсическому действию супероксидов даже в условиях интенсивной генерации активных форм кислорода. Церулоплазмин обладает как специфической, так и неспецифической антиоксидантной активностью.
Клинические наблюдения показывают, что содержание церулоплазмина возрастает при хроническом холестатическом гепатите (в 1,8 раза) и при первичном билиарном циррозе (в 2 раза), тогда как активность СОД в этих случаях снижается на 23—25 %.
У здоровых животных содержание в крови церулоплазмина колеблется от 150 до 550, в том числе у кур от 50 до 120 мкмоль бензохинона/л • мин.
Источники: 3, 11, 70.
Определение антиокислительной активности (AOA) плазмы крови. Принцип. Метод основан на регистрации скорости окисления восстановительной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде. При этом бесцветная лейкоформа 2,6-ДХФИФ переходит в окрашенную форму, имеющую максимум поглощения при 600 нм.
Реактивы: 0,25 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4. 7,8 г NaH2PO4 • 2H2O, растворяют в 100 мл дистиллированной воды и
184
11,4 г K2HPO4 • 3H2O — в 100 мл дистиллированной воды. К 81 мл второго раствора приливают 19 мл первого раствора и устанавливают нужное значение pH с помощью pH-метра. Затем раствор доводят до 200 мл дистиллированной водой;
0,8 ммоль/л водный раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола в окисленной форме. Для этого 11,6 мл 2,6-ДХФИФ растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.
3,2 ммоль/л раствор закисного сернокислого железа. 44,5 г FeSO4 • 7H2O растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.
Оборудование: спектрофотометр с термостатируемой кюветой или спектрофотометр «Спекол» с термостатируемой кюветой; ультратермостат; баня водяная; весы аналитические; колбы мерные; пипетки измерительные; микропипетки или микрошприц на 10 и 20 мкл.
Ход определения. В термостатируемую кювету последовательно добавляют 0,5 мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,15 мл раствора 2,6-ДХФИФ, 0,15 мл раствора закисного сернокислого железа и быстро перемешивают. Все растворы должны иметь температуру 37 °С. Сразу после перемешивания быстро добавляют 10 или 20 мкл плазмы крови, перемешивают и через каждые 30 с (по секундомеру) после добавления плазмы на протяжении 5 мин измеряют оптическую плотность при 600 нм против воды (D^0n).
Определяют оптическую плотность при 600 нм инкубационной среды, в которой 2,6-ДХФИФ окислен полностью. Для этого в кювету добавляют те же компоненты, но вместо раствора FeSO4 и пробы добавляют равные им объемы дистиллированной воды
(Диакс)-
Расчет результатов начинают с определения констант скоростей окисления 2,6-ДХФИФ в контроле (А"контр) и опыте (K0n) по формулам
к = '"4пах-'п(Апах-Д5к) „ к = Anax - "КАпах - Aon) "контр ^ " аоп ^ j
где In — логарифм натуральный (положительный).
Рассчитывают константу ингибирования (Ки) плазмой крови окисления 2,6-ДХФИФ, являющуюся показателем ее антиокислительной активности по формуле
где K11 — антиокислительная активность плазмы крови, мл • мин-1; Кк — константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в контроле; А^,п — константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте; С — концентрация плазмы в инкубационной смеси, мг/л.
185
Примечания. 1. Плазма крови должна быть без гемолиза. 2. Исследование должно проводиться не позднее 6 ч после взятия крови. Клиническое значение. AOA крови свидетельствует о суммарной защите организма от токсичных для структур клеточных мембран и функциональной активности белков — ферментов продуктов ПОЛ. Повышение AOA крови свидетельствует о высокой способности организма противостоять воздействию факторов, активизирующих свободнорадикальное окисление липидов; снижение, наоборот, указывает на уменьшение его антиокислительной защиты.
Антиокислительная активность плазмы крови у животных колеблется от 0,8 до 2,5, в том числе у кур от 0,2 до 0,5 л х мин-1 • 10 . Источник: 11.
3.3.9. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ
Для контроля за обеспечением животных витаминами, своевременной диагностики гиповитаминозов анализируют не только обеспеченность витаминами рационов, но и определяют их содержание в крови, молозиве, молоке, печени и других тканях, а также используют косвенные показатели. При изучении обмена витаминов применяют биологические, химические, физико-химические, изотопные и другие методы. Содержание витаминов в биологических субстратах чаще определяют с помощью колориметрических, спектрофотомет-рических, спектрофлуориметрических и газохроматографических методов. Из-за сложности методов прямое определение концентрации многих витаминов в крови и других биологических субстратах проводится редко.
