Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Содержание общего тиамина в крови колеблется в пределах 7—15 мкг%, в печени 8—13 мкг/г. При этом в плазме крови обна-
192
руживается преимущественно свободный тиамин, в эритроцитах и лейкоцитах — фосфорилированный. Сезонной зависимости содержания тиамина в крови не обнаружено.
Гиповитаминоз Bi проявляется при содержании общего тиамина в цельной крови ниже 5—6 мкг%, в печени менее 0,3 мкг/г. Уровень пировиноградной кислоты при этом превышает 0,7—1,2 мг%. В условиях интенсивного выращивания и откорма бычков в пром-комплексах при содержании общего тиамина в крови 5 мк% и ниже И. С. Шалатонов (1982) отмечал выраженные признаки алопеции. Низкий уровень тиамина в крови, печени и других тканях наблюдается при цереброкортикальном некрозе. Подавляется бактериальный синтез витамина В[ в желудочно-кишечном тракте при скармливании животным антибиотиков и аминазина.
Определение общего рибофлавина в крови. Принцип. Метод основан на экстракции различных форм рибофлавина из крови при помощи трихлоруксусной кислоты с последующим кислотным гидролизом флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флуориметри-ческим определением содержания общего рибофлавина.
Реактивы: 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;
4 моль/л раствор калия фосфата двузамещенного (K2HPO4);
10%-ный раствор натрия гидросульфита (NaHS2O4) в 5%-ном растворе натрия гидрокарбоната (NaHCO3). Готовят непосредственно перед употреблением;
калибровочный основной раствор рибофлавина, содержащий 100 мкг в 1 мл. Рабочий калибровочный раствор рибофлавина с содержанием 20 мкг в 1 мл: 10 мл основного раствора разводят до 50 мл дистиллированной водой.
Оборудование: пробирки центрифужные; пипетки на 1 мл; пробирки с притертыми пробками; термостат; флуори-метр.
Ход определения. Первый вариант. В центрифужную пробирку вносят 2 мл оксалатной крови и 8 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (или 2 мл крови, 3 мл дистиллированной воды и 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты). Тщательно перемешивают стеклянной палочкой, оставляют в темноте на 60 мин. Затем содержимое пробирки снова перемешивают и центрифугируют при 3000 мин 1 в течение 30 мин. Прозрачную надосадочную жидкость помещают в термостат при температуре 37—38 °С на 20 ч или при комнатной температуре на 2 сут для гидролиза ФАД. После этого пробирку охлаждают и к 8 мл гидролизата приливают 2 мл 4 моль/л раствора K2HPO4, перемешивают и оставляют стоять 1—2 ч в темноте для нейтрализации. Затем измеряют флуоресценцию при помощи флуориметра с первичным светофильтром, имеющим максимум поглощения около 420 нм, и со вторичным — с максимумом поглощения около 560 нм.
Для измерения нейтрализованный раствор вносят в кювету флуориметра и делают первый замер интенсивности флуоресценции
13 — 4196
193
(P]). Затем сливают из кюветы испытуемую жидкость обратно в пробирку и добавляют туда 0,1 мл рабочего калибровочного раствора рибофлавина (0,1 мл содержит 2 мкг рибофлавина) и получают раствор, содержащий 0,2 мкг в 1 мл. Полученный раствор снова замеряют на флуориметре и получают второй замер (P2). После этого гасят флуоресценцию, приливая 0,5 мл 10%-ного раствора NaHS2O4. Сразу после добавления этого раствора во избежание частичного обратного окисления рибофлавина производят третий замер (/?).
Расчет содержания рибофлавина (х) ведут по формуле
Количество мкг рибофлавина в 1 мл стандарта - (Р, - Р\)
X = -;-¦-— • 100.
Количество мл крови ¦(P2-P1)
Второй вариант. Вытяжку и калибровочный рабочий раствор рибофлавина вносят в две одинаковые пробирки или кюветы и измеряют интенсивность их флуоресценции посредством флуори-метра по шкале гальванометра. В обе пробирки прибавляют на кончике шпателя NaHC03 и NaHS2O4 (примерно по 0,1 г) для гашения флуоресценции рибофлавина и снова измеряют флуоресценцию.
Расчет содержания рибофлавина ведут по формуле
(А-Б) -20. VV2 BnV1
где X — содержание рибофлавина, мкг%; А — показания флуориметра для испытуемого раствора (первый отсчет); Б — показания флуориметра для испытуемого раствора после погашения (второй отсчет); В — показания флуориметра для калибровочного раствора, содержащего 20 мкг в 1 мл; 20 — содержание рибофлавина в 1 мл калибровочного рабочего раствора, мкг; л — количество крови, мл; V — общее разведение, мл; K1 — фильтрат, взятый на окисление, мл; V2 — фильтрат после окисления, мл.
Источники: 8, 75.
Клиническое значение. Источник рибофлавина — корма, кроме того, он синтезируется бактериями преджелудков и кишечника. Бактериальный синтез рибофлавина наиболее выражен у жвачных животных, поэтому при рациональном их кормлении они не испытывают недостатка этого витамина. В слизистой оболочке кишечника, в печени и других тканях рибофлавин при участии АТФ фосфорилируется и превращается в активные соединения — коферменты флавин-мононуклеоитид (ФМН) и фла-вин-адениннуклеотид (ФАД). Оба они участвуют в окислительно-восстановительных процессах в составе дегидрогеназ и оксидаз. ФМН служит коферментом дегидрогеназ, которые катализируют окислительное дезаминирование некоторых аминокислот и других