Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Определение витамина А и каротина в сыворотке крови по Бес-сею в модификации В. И. Левченко и сотр. Принцип. Метод основан на щелочном гидролизе и экстракции витамина А и каротина из сыворотки крови, молозива (молока) малолетучими растворителями и последующем спектрофотометрическом измерении поглощения света раствором (при длине волны 328 нм для витамина А и 460 нм для каротина) до и после разрушения витамина А ультрафиолетовыми лучами.
Реактивы: раствор калия гидроксида 1 моль/л в 96%-ном этиловом спирте. К 5,6 г KOH добавляют 6 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят объем до 100 мл этанолом, тщательно перемешивают (или берут 1 объем 1 н. KOH и 10 объемов 96%-ного этанола). Реактив готовят перед работой;
ксилол-октановая смесь (1 : 1, х. ч.). В необходимых случаях ксилол перегоняют. Реактив готовят за несколько часов до начала анализа.
186
Оборудование: спектрофотометр СФ-46, СФ-16 или фо-тоэлектроколориметр КФК-2, КФК-3; ртутно-кварцевая лампа ДРТ-400; вентилятор настольный; водяная баня; пробирки из стекла «пирекс», пропускающие ультрафиолетовые лучи с притертыми пробками (55 • 8 мм); пипетки с резиновыми баллончиками или со шприцем для отсасывания жидкости.
Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по 2 мл сыворотки крови (молозива) и 1 моль/л спиртового раствора КОН, перемешивают тонкой стеклянной палочкой до образования однородной смеси и ставят для гидролиза в водяную баню на 20 мин при 60 °С (через каждые 10 мин перемешивают). После гидролиза пробирки охлаждают в течение 10 мин в морозильной камере холодильника. В каждую из них вносят по 4 мл ксилол-октановой смеси, закрывают пробками, интенсивно встряхивают в течение 2—3 мин, снова охлаждают 5—7 мин, а затем центрифугируют 10—15 мин при 3000 мин . Верхний слой, который содержит экстракт витамина А и каротиноидов в ксилол-октановой смеси, отбирают пипеткой в пробирки из стекла «пирекс».
Фотометрию проводят в кювете с толщиной слоя 10 мм, а для контроля используют ксилол-октановую смесь. На СФ-46 каротин определяют при длине волны 460 нм, ретинол — при 328 нм; на КФК-2 или КФК-3 при длине волн соответственно 440 и 315 нм.
Оптическую плотность смеси для определения витамина А проводят до и после обработки пробирок ультрафиолетовыми лучами в течение 50 мин. Для этого пробирки из стекла «пирекс» плотно закрывают притертыми стеклянными пробками и ставят на расстояние 15—20 см от лампы ДРТ-400 или ПРК-5. Для охлаждения пробирок тотчас включают два настенных вентилятора. По разнице оптической плотности смеси, полученной при фотометрии до и после облучения ультрафиолетовыми лучами, находят концентрацию витамина А в сыворотке крови (молозиве).
Расчет ведут при определении витамина А на СФ-16 или СФ-46 по формуле
A = (E1- E2)-1274, а при определении на КФК-2 или КФК-3 по формуле
A = (Ex- E2) ¦ 1500,
где А — концентрация витамина А, мкг/100 мл; E1 — экстинкция раствора до воздействия волной 315 нм; E2 — экстинкция раствора после воздействия волной 315 нм; 1274 и 1500 — коэффициенты для определения витамина А.
Концентрация каротина при определении на СФ-16 или СФ-46 равна E- 762, а при определении на КФК-2 или КФК-3 — E- 850,
где E — экстинкция раствора при воздействии длины волны 440 нм; 762 и 850 — коэффициенты для определения каротина.
Источники: 8, 20, 21.
187
Клиническое значение. Основными формами витамина А является витамин А-спирт (ретинол) и его производные в форме сложного эфира (ретинолпальмитата) с пальмитиновой кислотой. Главный источник витамина А в организме животных — каротин. Усвоение его и витамина А происходит в кишечнике, при этом принято считать, что усваивается только 1/3—1/4 часть каротина и около 1/7 части его превращается в витамин А. 25—50 % витамина А переходит в печень.
В условиях полноценного белкового питания, хорошей обеспеченности витамином Віз, а также использования антиоксидантов повышается активность каротиндиоксигеназы, увеличивается количество молекул каротина, расщепляющихся по центру, в 1,5—2 раза возрастает эффективность синтеза витамина А.
Действие витамина А проявляется в обеспечении нормального роста и развития животных, дифференцировании эпителиальной и костной тканей, регуляции обмена веществ.
Содержание витамина А в сыворотке крови у клинически здоровых телят 5—10-дневного возраста составляет 9—15 мкг/100 мл, у телят месячного возраста 12,5—25; у 3-месячных — 15—35; у молодняка старше 3-месячного возраста 30—80; у коров в стойловый период 25—80, в пастбищный период 40—150; у свиней 20—50; у овец и лошадей 15—25 мкг/100 мл. В молозиве коров первого удоя в стойловый период содержится 140—500 мкг/100 мл витамина А, в пастбищный период 150—580 мкг/100 мл, в молоке соответственно 30—80 и 80—210 мкг/100 мл. В желтке куриных яиц — 6—75 мкг/г.
Снижение количества витамина А в крови, печени, молозиве и молоке отмечают при недостатке каротина и витамина А в кормах, плохом усвоении их вследствие хронических заболеваний органов пищеварения и печени. При снижении в крови витамина А ниже 10 мкг%, а в печени ниже 50 мкг% у взрослых животных появляются симптомы гиповитаминоза, задерживается спермогенез, сперматозоиды становятся малоподвижными, теряют оплодотворяющую способность, нарушается строение и функция эпителия органов дыхания, пищеварения, репродуктивная способность самок, появляются респираторные болезни и др.
