Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
* В величины P2 и P) вводят поправки на разведение, т. е. умножают на соответствующее разведение.
194
веществ. ФАД является коферментом дегидрогеназ ?-окисления жирных кислот, сукцинаддегидрогеназы, ксантинкиназы и других ферментов.
У здоровых животных в крови 8—15 мкг%, в печени 39,6— 46,6 мкг/г общего рибофлавина. Снижение содержания рибофлавина в крови и печени отмечается при недостаточном его поступлении с кормом, даче животным внутрь антибиотиков, аминазина, обладающих антивитаминным действием и подавляющих бактериальный синтез. При гиповитаминозе B2 уровень рибофлавина в крови телят составляет 6 мкг% и ниже.
Определение токоферолов в плазме крови с а,а'-дипиридилом (2, 2'-дипиридил). Принцип. Метод основан на окислении токоферолов хлорным железом и определении образовавшегося Fe в виде окрашенного комплекса с а,гх'-дипиридилом, обладающим максимумом поглощения при 520 нм. Поправка на каротиноиды вносится по поглощению при 460 нм. Эфиры токоферолов при их определении гидролизуют KOH в присутствии аскорбиновой кислоты. Свободный токоферол определяют без окисления.
Реактивы: абсолютный этиловый спирт, перегнанный над таблетками калия гидроксида (КОН) и кристаллами калия перман-ганата (KMnO4). Очистка от альдегидов: этиловый спирт перегоняют над таблетками KOH и кристаллами KMnO4, выбрасывая первую и последнюю фракции (до 10 % общего объема);
концентрированный раствор калия гидроксида (КОН) — 50 г KOH в 50 мл дистиллированной воды;
10%-ный раствор кислоты аскорбиновой в дистиллированной воде. Готовят непосредственно перед опытом и нейтрализуют несколькими каплями концентрированной КОН;
0,3%-ный раствор ос,а'-дипиридила в н-пропиловом спирте. Сохраняют в склянке из темного стекла;
ксилол очищенный (х. ч.). Препарат встряхивают в делительной воронке с 3—4 порциями концентрированной серной кислоты (H2SO4), пока кислотный слой не перестанет окрашиваться, промывают водой, насыщенным раствором перманганата калия, вновь водой до удаления окраски KMnO4, сушат над безводным Na2SO4 и перегоняют, отбрасывая первые и последние 10 % отгона;
0,12%-ный раствор FeC^ • 6H2O в абсолютном этиловом спирте. Сохраняют в темной склянке;
0,Ь-ос-токоферол, калибровочный раствор в абсолютном спирте этиловом концентрацией 100 мкг/мл.
Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; пробирки 18 X 1,5 см с притертыми пробками; пробирки центрифужные; центрифуга.
Ход определения свободного токоферола. К 2 мл плазмы (сыворотки) крови приливают 1 мл дистиллированной воды и 3 мл абсолютного этилового спирта, добавляемого по каплям при перемешивании. Доливают 5 мл ксилола, закрывают
13*
195
пробкой, интенсивно перемешивают 6 мин и центрифугируют 5—10 мин при 3000 мин . Отбирают 3 мл ксилолового экстракта, измеряют его оптическую плотность при длине волны 460 нм (поправка на каротины) против воды, прибавляют 1 мл раствора ос,а'-ди-пиридила в н-пропиловом спирте, перемешивают, добавляют 1 мл раствора FeCl3 • 6H2O, тщательно перемешивают и точно через 2 мин фотометрируют при длине волны 520 нм против воды. Одновременно таким же образом обрабатывают контроль на реактивы, содержащий вместо плазмы (сыворотки) крови 2 мл воды. Для определения содержания токоферолов рассчитывают оптическую плотность токоферолов по формуле
De= Z)52O-(Ок + 0,217)Д460,
где De — оптическая плотность токоферолов; D^o — оптическая плотность опытной пробы при 520 нм; DK — оптическая плотность контрольной пробы при 520 нм; 0,217 — экспериментально определенная поправка на оптическую плотность, обусловленную присутствием каротиноидов; — оптическая плотность опытной пробы при 460 нм.
Концентрацию свободного токоферола рассчитывают по калибровочной кривой, для построения которой используют калибровочный раствор 0,Ь-ос-токоферола при содержании последнего от 10 до 100 мкг в пробе.
Ход определения суммарного токоферола и его эфиров. В пробирках 18 х 1,5 см с притертыми пробками смешивают 2 мл плазмы (сыворотки) крови, 1 мл 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты, 0,2 мл концентрированной KOH и 3 мл абсолютного спирта. Вносят в пробирки шарики или осколки кварцевого стекла, накрывают их небольшими воронками и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню так, чтобы пробирки были углублены в воду на 2 см. Верхнюю часть пробирок охлаждают током воздуха из воздуходува. Через 10 мин пробирки охлаждают холодной водой, добавляют 5 мл ксилола, интенсивно перемешивают 8 мин, центрифугируют 5—10 мин при 3000 мин и далее обрабатывают, как описано выше.
Содержание эфиров токоферола рассчитывают по разности между количеством суммарного и свободного токоферола. По данным ряда авторов, содержание свободного токоферола в плазме крови в 6—6,5 раза больше эфиров.
Примечания. 1. Желательно работать в затемненном помещении и проводить фотометрирование через строго определенное время после добавления дипириди-ла, так как окраска нестабильна. 2. Сыворотку (плазму) крови можно хранить при комнатной температуре в течение 1 сут, при 5 °С 2 нед и при минус 20 °С 2 мес. Источник: 75.
