Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. Принцип метода общий для хрома-
196
тографии. Наиболее удачный адсорбент для удаления примесей — оксид алюминия.
Реактивы: 96%-ный этиловый спирт;
абсолютный этиловый спирт; чистый бензол (без тиофена);
концентрированная серная кислота (H2SO4);
безводный натрия сульфат;
оксид алюминия для хроматографии, сильно активированный; петролейный эфир; углекислота или азот;
0,2%-ный раствор железа хлорного (FeCl3)b абсолютном спирте;
0,5%-ный раствор а,а'-дипиридила в абсолютном спирте;
стандартный раствор токоферола (250 мг 0,Ь-а-токоферола растворяют в мерной колбе ледяной уксусной кислотой до объема 250 мл).
Оборудование: адсорбционная колонка; фотоэлектро-колориметр; колбы; пипетки; пробирки; бюхтеревская воронка; делительная воронка; песочная баня.
Очистка алюминия оксида. 400 г алюминия оксида, используемого в качестве адсорбента, суспензируют в 200 мл концентрированной H2SO4, в которой до этого было растворено 20 г цинка хлорида. Добавляют 20 мл дистиллированной воды и ставят колбу в холодильник на 72 ч. Подготовленный таким образом алюминия оксид переносят в бюхтеровскую воронку, промывают обычной водой до нейтральной реакции, затем ацетоном и сушат на воздухе. Отвешивают необходимое количество приготовленного адсорбента и прокаливают его в муфельной печи при температуре 450 °С в течение 6 ч. Перед употреблением влажность алюминия оксида доводят дистиллированной водой до 9 %.
Адсорбционная колонка. Хроматографию проводят в стеклянной трубке диаметром 10 мм, заполненной адсорбентом на высоту 80 мм. Рыхлость слоя должна быть такой, чтобы он пропускал 30 капель за 1 мин. Для предотвращения увлажнения адсорбента сверху насыпают безводный натрия сульфат. Перед началом хроматографии через колонку пропускают чистый петролейный эфир (5—6 мл), регулируя скорость капания.
Ход определения. 2 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в сухую делительную воронку (50 мл), прибавляют 10 мл этилового спирта, смесь энергично встряхивают 3 мин, после чего дважды экстрагируют 10 мл бензола при встряхивании по 3 мин. Объединенный безбелковый экстракт со следами спирта высушивают над безводным натрия сульфатом в защищенном от света месте.
Навеску ткани (1—3 г) гомогенизируют с 20 мл спиртово-бен-зольной смеси (1 : 1), переносят в круглодонную колбу, закрывают пробкой и экстрагируют в течение 30—40 мин. После этого спир-тово-бензольный экстракт фильтруют в делительную воронку и омыляют свежеприготовленным 50%-ным раствором KOH (55 % объема омыляемого вещества). Так как токоферол очень чувстви-
197
телен к воздействию щелочей и легко ими разрушается, процесс омыления проводят при полном отсутствии кислорода или под защитой антиокислителей. С этой целью в делительную воронку несколько раз вводят CO2 или высыпают 50—100 мг пирогаллола.
После окончания омыления в делительную воронку добавляют 50 мл дистиллированной воды с 1 мл концентрированной H2SO4 для нейтрализации КОН. Тщательно взбалтывают смесь и отделяют бензольную фракцию. Содержимое воронки промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Экстракт сушат в колбе над безводным натрия сульфатом. Высушенный бензольный экстракт фильтруют в низком тигле, споласкивая осадок чистым бензолом, и выпаривают досуха на песочной бане при температуре 60 °С.
Хроматография. Неомыленный осадок растворяют в эфире трижды, используя по 5 мл его каждый раз, и наносят на подготовленную адсорбционную колонку. Каротиноиды вымывают петро-лейным эфиром. Токоферол экстрагируют 5—6 раз бензолом (по 1 мл). Элюат выпаривают в токе нейтрального газа, а сухой остаток растворяют в абсолютном спирте и доводят объем до 4,6 мл. Добавляют 0,2 мл а,а'-дипиридила. Колориметрируют при 490 нм через 2,5 мин после добавления FeC^. Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору 0,Ь-а-токоферола.
Источники: 74, 75.
Клиническое значение. Богаты токоферолами растительные масла, зародыши пшеницы, ячменя и других злаковых культур. Всасываются токоферолы в тонком кишечнике при наличии в корме жиров. Непосредственное участие в этом процессе принимают желчные кислоты. Основная функция токоферола — регуляция интенсивности свободных радикалов в клетках, ограничение скорости процессов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот в липидах биологических мембран. Благодаря токоферолу обеспечивается стабильность клеточных мембран. Токоферолы защищают витамин А от перекисного окисления, являются си-нергистами селена — тормозят перекисное окисление липидов. Селен как кофактор глутатионпероксидазы участвует в инактивиро-вании гидропероксидов липидов.
Недостаточность токоферола сопровождается усилением процессов перекисного окисления липидов, атрофией семенников и бесплодием, рассасыванием плода на ранних сроках беременности, мышечной дистрофией, некрозами печени и мозга и т. д.
В норме сыворотка крови здоровых животных содержит 0,6— 1,4 мг% (14—34 мкмоль/л) токоферолов. У новорожденных животных их 0,3—0,5 мг% (7—12 мкмоль/л). Причина гиповитаминоза E — недостаток в кормах токоферолов, плохое их усвоение вследствие заболевания печени, желудка и кишечника. Уровень витамина E в крови также зависит от степени обеспеченности организма ?-липопроте-идами, ответственными за транспорт токоферолов в организме.
