Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Количество гемоглобина в гемолизатах определяют цианидным методом с помощью специальных наборов НПО «Биореактив».
Процент торможения СОД образования фармазана п-НТХ определяют по формуле
т= Е*~Е°П -100,
где T — процент торможения реакции; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; E0n — оптическая плотность опытной пробы; Ещ, — оптическая плотность пробы контроля на реактивы; 100 — коэффициент для перевода в проценты.
Принято считать, что 50 % ингибирования реакции соответствует одной относительной единице (1 отн. ед.) активности фермента.
Количество отн. ед. активности фермента, внесенного в пробу, рассчитывают по формуле
M = 10(0.026-7--1,3),
где M — количество отн. ед. активности в пробе; T — процент торможения реакции.
Активность СОД в пересчете на содержание гемоглобина рассчитывают по формуле
0,1236?гем '
где А — активность фермента (СОД), ед. акт/мг гемоглобина; M — количество единиц фермента в пробе; Ест — оптическая плотность стандартного раствора, содержащего 59,75 мг гемоглобинцианида в 100 мл; E^n — оптическая плотность опытной пробы гемолизата при определении гемоглобина.
Примечания. 1. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при 4 °С не более 1 сут. 2. Химические пробирки, в которых ведется определение активности фермента, должны быть одинаковыми по диаметру, толщине стенок и цвету стекла. 3. В добавке биологического материала должна содержаться примерно 1 ед. активности фермента (степень торможения должна составлять 35—55 %). 4. При определении активности СОД в эритроцитах крови птиц отмытую эритроцитарную массу из 0,5 мл крови лизируют 2,5 мл холодной дистиллированной воды. Центрифугируют при 3000 мин в течение 15 мин для осаждения ядер эритроцитов. Берут 1,5 мл надосадочной жидкости и далее продолжают исследование, как указано выше.
174
Клиническое значение. Супероксидцисмутазавстречается во всех клетках и является ключевым ферментом антиокси-дантной защиты в организме, которая попарно дисмутирует (превращает) супероксидные анионы в пероксид водорода и молеку-_ _ 2 н+
лярный кислород (O2 + O2 + -» H2O2 + O2) и тем самым
СОД
защищает клетки от токсичных форм кислорода в самом начале процесса ПОЛ. Активность СОД в крови и печени повышается в 1,5—5 раз во всех случаях, когда в клетках нарастает концентрация
супероксидных анионов (O2 ), что наблюдается при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, легких, инфаркте миокарда и других заболеваниях сердца и сосудов, термических ожогах, болезнях печени, особенно при жировой дистрофии, при онкологических поражениях, химических отравлениях, эмоционально-болевых и других стрессах.
Снижение активности СОД отмечено при ишемии миокарда, печени, почек, скелетных мышц, хотя уровень липидных перокси-дов в этих случаях возрастает. Аналогично снижается активность СОД при хроническом гепатите, фиброзе, циррозе, глубоких деструктивных поражениях печени.
Показатели активности СОД у здоровых взрослых животных и птиц колеблется от 1,0 л 7,5 ед. акт/мг гемоглобина.
Источники: 11, 26, 47.
Определение активности катал азы (КФ 1.11.1.6) в крови. Принцип. Метод основан на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм.
Реактивы: 0,04412 н. раствор пероксида водорода. Готовят примерно 0,08%-ный раствор H2O2 и устанавливают точную концентрацию титрованием 0,01 н. раствором KMnO4. На титрование 5 мл 0,04412 н. раствора H2O2 должно пойти 22,06 мл 0,01 н. раствора KMnO4. По результатам титрования раствор H2O2 доводят до нужной концентрации дистиллированной водой;
4,5%-ный раствор аммония молибденовокислого. 4,5 г молиб-дата аммония растворяют в 95,5 мл дистиллированной воды;
0,1 моль/л трис-НС1-буфер, pH 7,4;
буферно-субстратная смесь: 10 мл трис-НС1-буфера смешивают с 30 мл 0,04412 н. раствора H2O2.
Оборудование: спектрофотометр; баня водяная; весы аналитические; секундомер; бюретки; пипетки с делениями; пробирки химические.
Ход определения. К0,5мл гепаринизированной крови приливают 3,5 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают и оставляют на 5—10 мин при комнатной температуре — основной гемолизат. К 0,2 мл основного гемолизата прибавляют 3,8 мл воды и тщательно перемешивают — рабочий гемолизат. В две химические пробирки наливают по 2 мл буферно-субстратной смеси и
175
выдерживают в водяной бане при 37 °С в течение 10 мин. В одну из пробирок (опытную) добавляют 0,1 мл рабочего гемолизата, тщательно перемешивают и инкубируют в водяной бане при 37 °С в течение 3 мин (по секундомеру). Реакцию останавливают добавлением в опытную пробу сначала 2 мл молибдата аммония, а затем 0,1 мл рабочего гемолизата.
Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб при 410 нм в кювете с ходом луча 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь, состоящую из 1 мл буфера, 3 мл дистиллированной воды и 0,1 мл рабочего гемолизата.
Активность каталазы рассчитывают по формуле
^ (A-S0nM,!-16-IQ*-10« 22,2 ¦ 106•3
