Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Позже опыты по тепловой инактивации термолизина были проведены в других условиях: фермент в 50 мМ трис-буфере, pH. 7, содержащем 10 мМ СаС12 инкубировали при 80°С в течение 1 ч. Активность измеряли при 45°С. Хотя максимальные скорости реакции у исходного и прогретого фермента были одинаковы, величина Км после тепловой обработки значительно возрастала, что свидетельствует о возникновении в белке небольшого конформационного изменения. Отсутствие значительного кон-фор мационного изменения подтверждается тем, что внутренняя вязкость нативного и подвергнутого тепловой обработке фермента была практически одинаковой (Ohta, 1967). Термолизин, прогретый при 80°С в течение 1 ч был обозначен как «модифицированный фермент».
3. Физико-химические свойства
Ота и др. (Ohta et al., 1966) сообщили о наличии в нативном ферменте 19 аномально ионизирующихся остатков тирозина и о выявлении методом кругового дихроизма эффекта Коттона; однако в «модифицированном ферменте» не было обнаружено ни аномальной 'ионизации тирозина (Otha, 1967), ни эффекта Коттона. Кривые pH — стабильность при 20°С заметно отличались от аналогичных кривых при 80°С (в условиях, когда исчезают аномально ионизирующиеся радикалы), но в интервале pH, в котором ионизация тирозина не происходит, фермент был стабилен при обеих температурах. Был сделан вывод, что 19 тнрози-новых остатков стабилизируют фермеит благодаря тому, что их фенольные группы участвуют в образовании водородных связей, а ароматические кольца в гидрофобных взаимодействиях. Ота (Ohta, 1967) сообщил также, что удаление из’термолизина ионов Са2+ путем диализа против раствора ЭДТА приводит к утрате ферментативной активности и к уменьшению содержания участ-
ков со спиральной конформацией; он подчеркнул, что Са2+ играет важную роль в стабилизации термолизина. В отношении других свойств термолизин сходен с панкреатической карбоксипеп-тидазой (Petra, 1970); это касается зависимости активности от pH, ответной реакции на ингибирование хелатобразующими агентами, молекулярного веса (35 000), аминокислотного состава (за исключением того, что в термолизине отсутствует цисте-ин или цистин) и содержания цинка (1 г-атом-моль-1). При комнатной температуре в 8 М растворе мочевины денатурацию термолизина не удалось обнаружить ни одним из использованных методов: измерение разностных спектров и спектров флуоресценции остатков триптофана, дисперсия оптического вращения, обусловленная пептидными группами, и круговой дихроизм, вызванный присутствием остатков тирозина (Ohta, 1967). Заметная денатурация белка (измеренная по изменению оптической плотности) при 70°С наблюдалась после комбинированного воздействия тепла и 8 М раствора мочевины. Скорость денатурации существенно не зависела от концентрации фермента, но зависела от pH, присутствия ионов Са2+ и от величины ионной силы.
При определении аминокислотной последовательности термолизина (Titani et al., 1972) в соответствии с данными , Ота и др. (Ohta et al., 1966) было показано, что в нем содержится два остатка метионина и отсутствует цистеин или цистин, однако вместо пяти остатков триптофана несколькими различными методами было обнаружено только три. В аминокислотной последовательности термолизина (316 остатков) можно заметить необычное распределение аминокислот, например между остатками 101 и 182 нет ни одного аргинина или лизина, hq в то же время здесь находятся десять остатков, содержащих карбоксильные группы; С-концевые остатки (227—316) имеют только четыре карбоксильные группы, но зато десять остатков основных аминокислот. Не удалось обнаружить заметной структурной гомологии между термолизином и бычьей карбоксипептидазой А (Bradshaw et al., 1969), хотя между этими ферментами существует множество других физико-химических аналогий. Исходя только из данных об аминокислотной последовательности термо-лизина был сделан вывод, что, он относится к особому классу ферментов, отличающихся от карбоксипептидаз млекопитающих и других протеаз известного строения. Ни одну из особенностей аминокислотной последовательности термолизина не удалось связать с термостабильностью этого фермента.
Была построена карта электронной плотности термолизина (Matthews et al., 1972а), позволившая идентифицировать многие из 316 аминокислотных остатков, что дало возможность составить представление об общей конформации фермента. Асимметричная форма этой молекулы была интерпретирована как ука-
зание на то, что отношение поверхности к объему у нее больше, чем у компактной сферы. Эта молекула имеет вид двух соприкасающихся сфер. Нижняя половина молекулы была описана как большое гидрофобное ядро, окруженное шестью спиральными участками, расположенными в С-концевой части молекулы. В дальнейшем была опубликована улучшенная карта электронной плотности этого белка (Matthews et al., 1974). Авторы пришли к выводу, что конформация термолизина лишена каких-либо ¦особенностей, которые могли бы объяснить его термостабильность, возможные исключения составляют четыре участка связывания кальция.
