Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Хокинг и Харрис (Hocking, Harris, 1976) сообщили также, что проводится рентгеноструктуриый анализ фермента из В. stearothermophilus (как апо-, так и голофермента), очень
сходного с ферментом из мышц омара. Из личного сообщения д-ра Харриса нам известно, что закончено определение аминокислотной последовательности субъединицы фермента из
В. stearothermophilus, обнаружившей высокую степень' гомологии с субъединицей фермента из Т. aquaticus. Кроме того, для ГФДГ из В. stearothermophilus построена молекулярная модель, основанная на структуре, установленной методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,9А. Харрис с сотрудниками готовят к публикации работы, касающиеся детального сравнения ГФДГ из мышц омара с ферментом из В. stearothermophilus. Можно надеяться, что с помощью рентгеноструктурного анализа будет выяснено, имеют ли значение для стабилизации термофильных ферментов замены в области активного центра, и будут обнаружены другие участки, стабилизирующие общую конформацию белка.
4. Иммунологические, кинетические
и генетические исследования
Получены антитела против ГФДГ из В. stearothermophilus, мышц кролика и дрожжей (Sauvan et al, 1972). Максимальное подавление ферментативной активности гомологичной антисывороткой составило 94% для фермента дрожжей, 96% для термофильного фермента и 50% для фермента из мышц кролика. Не было обнаружено перекрестного ингибирования какого-либо из этих ферментов гетерологичными антисыворотками. Преин-кубацня с NAD+ не оказывала влияния на ингибирование гомологичной антисывороткой термофильного фермента, но снижала ингибирование антисывороткой ферментов из дрожжей и мышц кролика. Не удалось обнаружить перекрестной реакции ни одного из указанных ферментов с гетерологичными антисыворотками в реакциях преципитации, при иммунодиффузии и иммуноэлект-рофорезе.
При изучении кинетики реакции, катализируемой термофильной ГФДГ, были определены величины Км и Vmax для субстрата и кофермента (Amelunxen et al., 1974) при pH 8,6 и 10^ (оптимум) в пределах температурного интервала от 30 до 60°С. Значительная термостабильность фермента обеспечила возможность изучения влияния температуры на кинетические параметры без осложнений, вызываемых инактивацией фермента. Было установлено, что для глицеральдегид-3-фосфата (ГФ) величина Км при pH 8,6 соответствовала 7,1-10-4 как при 30, так и при 60 С, а при pH 10 3,5• 10—4 при обеих температурах. Величина Ктах при pH 8,6 возрастала более, чем в 3 раза при повышении температуры от 30 до 60°С, однако при pH 10 изменения были незначительными. Хокинг и Харрис (Hocking, Harris, 1976) сооб-
щили, что в реакции, катализируемой ГФДГ из Т. aquaticus, величина Км для ГФ была равна 7,5 • 10-4 (как при 25, так и при 35°С), тогда как Vmax при повышении температуры от 25 до 35°С увеличивалась более чем в 2 раза. Фуджита и др. (Fujita et al.,
1976) рассчитали Км для фермента из Т. thermophilus с использованием в качестве субстрата ГФ; она оказалась равной 3-10~4 при 30°С. Исходя из того, что приведенные для термофильных ферментов величины Км значительно выше соответствующих величин для ферментов из нетермофильных источников, например фермента из мышц кролика (Velick, 1955), можно предположить, что ферменты из термофильных источников в какой-то степени «жертвуют» каталитической эффективностью ради повышенной стабильности. Однако в сообщении Сузуки и Имахори (Suzuki, Imahori, 1973а), касающемся ГФДГ из мезофнла
В. cereus, для ГФ приводится величина Км, равная 5,1 * 10~4 М. при 20°С, что очень близко к величинам, указанным выше для ферментов из термофилов.
Выделение мутантов В. siearoihermophilus (Rowe et al., 1973) позволило осуществить генетический подход к изучению молекулярных основ термофилии и метаболизма термофилов. При использовании мутагена Ы-метил-Ы'-нитро-Н-нитрозогуаниднна были получены мутанты, блокированные по фумаразе, аконнтазе и алкогольдегидрогеназе. Имеется сообщение о некоторых свойствах двойного мутанта (лишенного аконптазиой и алькогольде-гидрогеназиой активностей) и двух мутантов В. stearothermophi-lus, у которых отсутствует фумаразная активность (Rowe et al.,
1976). У двойного мутанта алкогольдегидрогеназа совсем не синтезируется, а аконитаза синтезируется в иеактнвной форме. Были описаны как минимальные, так и имеющие определенный химический состав среды (жидкие и „плотные), обеспечивающие хороший рост В. stearothermophilus (Rowe el al., 1975). Плотные среды были использованы для выделения нескольких нуждающихся в аминокислотах мутантов этого организма. Такие среды должны существенно облегчить более детальные исследования генетики и метаболизма В. stearothermophilus 1503.
На основе накопленных данных становится очевидным, что ГФДГ из термофильных источников является наиболее полно охарактеризованным внутриклеточным ферментом, обладающим высокой внутренней термостабильностью. Физико-химические характеристики ясно показывают, что повышенная термостабильность этого фермента обусловлена не какими-то особыми структурными свойствами, а скорее всего определенными изменениями первичной и третичной структуры данного полипептида. Так как на уровне вторичной структуры термофильные и мезо-фильные ГФДГ, по-видимому, сходны между соб.ой, различия в стабильности должны быть связаны с ключевыми заменами ами-
