Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
одна из которых (аланин у всех видов рода Clostridium) расположена между остатками 21 и 22 ферредоксина М. aerogenes, а другая (аспарагиновая кислота у мезофильных клостридиев и треонин у термофильных клостридиев) —между остатками 25 и 26. Трехмерная структура ферредоксина М. aerogenes (Adman et al., 1973) показывает, что в образовании каждого из двух комплексов (4Cys — 4Fe — 4S) участвуют обе половины молекулы, так как в состав одного из них входят остатки цистеина в положениях 8, 11, 14 и 45, а в состав другого остатки цистеина в положениях 18, 35, 38 и 41. Это согласуется с общим представлением о том, что для образования активных центров ферментов необходима большая часть полипептидного остова. Однако это не исключает возможности утраты отдельных отрезков остова на участках, не-существенных для стабилизации уже сформированных активных центров.
Исходя из своей условной трехмерной модели ферредоксинов клостридиев, Перутц и Рейд (Perutz, Raidt, 1975) пришли к выводу, что повышенная стабильность термофильных ферредоксинов обусловлена главным образом внешними солевыми мостиками, связывающими остатки аминокислот, расположенных вблизи N-конца молекулы, с остатками, находящимися поблизости от ее С-коица. Примерами служат гистидин в положении 2, связанный с глутаминовой кислотой или глутамином в положении 44, а также глутаминовая кислота в положении 7, связанная с лизином-53. К другим солевым мостикам, которые могли бы экранировать активные группы белка, относятся гистидин в положении 24, связанный с глутаминовой кислотой в положении 25, и лизин в положении 29, связанный с глутаминовой кислотой в положении 31. Кроме того, мы предполагаем, что гистидин в положении 24 может обеспечивать дополнительное гидрофобное экранирование группы активного центра и стабилизацию внешней петли, образованной на этом участке вследствие его гидрофобного характера. В число водородных связей, возникающих в термофильных ферредоксинах, включены связи между гистидином в положении 2 и цистеином в положении 43, а также между серином в положении 10 и тирозином в положении 30. Если перечисленные выше изменения вносят вклад в повышение термостабильности белков, то, как отметили Перутц и Рейд (Perutz, Raidt, ,1975), различия в устойчивости к нагреванию между ферредоксинами должны уменьшаться при ослаблении солевых мостиков, например при возрастании pH или ионной силы. Был также сделан вывод о том, что в термофильных ферредоксинах не всегда обнаруживается большее число неполярных взаимодействий, чем в мезофильных аналогах.
При рассмотрении возможных механизмов термофилии применительно к термофильным ферредоксинам представляется
очевидным, что окончательные причины их термостабильности скорее^ всего будут выяснены только после установления трехмерной структуры мезофильных и термофильных ферредоксииов из разных видов Clostridium. Однако это не легко будет сделать, если основное различие между указанными ферредоксинами заключается в их сродстве к атомам железа и сульфид-ионам. При выяснении механизма термостабильности ферредоксииов из Т. lartarivorum и С. ihermosaccharolyticum необходимо принять во внимание температурный интервал проявления их термостабильности, так как он, вероятно, видоспецифичен. Поэтому сопоставление структур этих двух ферредоксииов, кажущееся на первый взгляд вполне оправданным, может привести к ошибочным заключениям. Следует также подчеркнуть, что в связи с очень низким молекулярным весом ферредоксииов и отсутствием у них субъединичной структуры эти белки не являются идеальной моделью, на основе которой можно делать выводы, касающиеся термостабильности высокомолекулярных белков, обладающих четвертичной структурой.
Если усиление связей, образуемых солевыми мостиками, действительно способствует возрастанию термостабилыюсти, использование в экспериментах высоких значений pH и ионной силы, ослабляющих такие связи, помогло бы, вероятно, объяснить различия в стабильности, наблюдаемые у ферредоксииов клостридиев. Однако при определении термостабильности фер-редоксинов клостридиев в 0,1 М растворе фосфата калия, pH 7,4 (Devanathan et al., 1969) заметной инактивации не наблюдалось,
и, следовательно, в этих условиях дестабилизации белков, по-видимому, не происходило.
В. ТЕРМОЛИЗИН
1. Введение
Термолизин представляет собой внеклеточную металлоэндо-пептидазу, первоначально выделенную и перекристаллизован-ную из Bacillus thermoproteolyticus (Endo, 1962). Этот фермент синтезируется в основном бактериями, функционирует при нейтральном pH и является эндопептидазой, катализирующей расщепление пептидных связей, в образовании которых участвуют аминогруппы гидрофобных аминокислот (Matsubara, Feder, 1971). По своей специфичности термолизин напоминает панкреатическую карбоксипептидазу A (Petra, 1970). От карбоксипеп-тидазы А термолизин отличается одной важной особенностью — присутствием связанного Са2+.
2. Термостабильность
Термостабильность термолизина была подробно изучена {Ohta et al., 1966). Ферментативная реакция инициировалась добавлением протеазы к субстрату (карбобензокси-Иу-Рго-Ьеи-Ala-Рго) при различных температурах в диапазоне 25—88°С. Между 25 и 80°С на графике Аррениуса наблюдалась линейная зависимость активности фермента от температуры. Выше 80°С сродство фермента к субстрату начинало снижаться. Авторы пришли к выводу, что механизм действия фермента одинаков как при низких, так и при высоких температурах и что фермеит сохраняет свою структуру в пределах достаточно широкого температурного интервала. Однако в приведенных выше экспериментах нельзя исключить возможного защитного эффекта субстрата.
