Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кашнер Д. -> "Жизнь микробов в экстремальных условиях" -> 154

Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.

Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях — М.: Мир, 1981. — 521 c.
Скачать (прямая ссылка): jiznmikrobovvextrimusloviyah1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 148 149 150 151 152 153 < 154 > 155 156 157 158 159 160 .. 267 >> Следующая

Для получения информации об активном центре термолизина и участках связывания кальция Мэттьюз и др. (Matthews et al., 1972b) сопоставили данные об его аминокислотной последовательности (Titani et al., 1972) с результатами рентгеноструктурного анализа. В формировании активного центра, который представляет собой проходящую через середину молекулы глубокую впадину с расположенным в глубине атомом цинка, участвуют аминокислотные остатки центрального участка полипептидной цени. Показано, что тремя лигандами цинка являются His-142, His-146 и Glu-166. Такое же сочетание аминокислот, играющих роль лигандов цинка, было обнаружено в бычьей карбоксипеп-тидазе A (Lipscomb et al., 1969), что свидетельствует о сходстве областей активных центров этих двух ферментов. Однако имида-зольное кольцо третьего остатка гистидина (His-231) расположено в термолизине напротив атома цинка, и именно в этом заключается основное структурное отличие данного фермента от карбоксипептидазы А.
При изучении ингибирования термолизина этоксимуравьи-ным ангидридом были получены данные, указывающие на то, что остаток гистидина имеет существенное значение для ферментативной активности (Burstein et al., 1974). Хотя этот агент реагирует в белках с боковыми цепями нескольких аминокислот, контрольные эксперименты показали, что только одна из этих групп ответственна за потерю ферментативной активности. Спектральные изменения, наблюдаемые в процессе реактивации фермента под действием гидроксиламина, служат дополнительным доказательством того, что реактивация фермента происходит в результате модификации какого-то одного остатка. Конкурентный ингибитор карбобензокси-Ь-фенилалаиии, связывающийся с активным центром термолизина, предохраняет фермент от ингибирования 14С-этоксимуравьиным ангидридом, предотвращая включение в него одной этоксиформильной группы. Найдено, что спектральные изменения в процессе этоксиформилиро-вания характерны для модификации остатков как гистидина, так и тирозина, однако при модификации тирозина спектральные из-
менения происходят независимо от присутствия конкурентного ингибитора. Представлены также и другие доказательства, свидетельствующие о существенной роли гистидина, в активном центре термолизина.
Что касается участков связывания кальция, то два соседних иона Са2+ (двойной участок), по-видимому, связываются внутри молекулы путем образования хелатных комплексов с пятью кислыми группами, а два других, отдельных иона Са2+ (одиночные участки) связываются на поверхности молекулы остатками аспарагиновой кислоты (Matthews et al., 1972b). Было показано (Feder et al., 1971), что удаление трех или четырех ионов Са2+, связанных с термолизином, приводит к утрате термостабильности. В работе, посвященной детальному исследованию структуры термолизина (Colman et al., 1972), авторы предположили, что два иона Са2+, расположенные поблизости от впадины активного центра, могут стабилизировать молекулу путем связывания двух ее половинок, каждая из которых имеет гидрофобную сердцевину, проходящую через впадину.
Недавно были опубликованы очень важные результаты дальнейших исследований, касающихся роли кальция в термостабильности термолизина (Dahlquist et al., 1976). Показано, что избыток ионов Са2+ стабилизирует нативный голофермент, препятствуя тому, что, по-видимому, является кооперативным структурным переходом, приводящим в конечном счете к автолизу фермента при температурах выше 50°С. Подобным стабилизирующим действием не обладают ни цинк (присоединяющийся к участку, отличному от участков связывания четырех ионов Са2+), ни тербий (присоединяющийся к двойному участку связывания Са2+). Если тербий присоединяется не к двойному участку связывания Са2+ а к другим участкам молекулы, то при этом также наблюдается ее стабилизация, что навело авторов на мысль о вовлечении в переход, вызывающий автолиз фермента, участка молекулы, отличного как от активного центра, так и от двойного участка связывания Са2+. При условии, что ионы тербия прочно присоединены к двойному участку связывания Са2+Г удаление двух других ионов Са2+ из соответствующих участков приводит к необратимому изменению фермента, сохраняющего лишь около 40% исходной каталитической активности. Однако измененный таким способом термолизин денатурируется при низкой температуре и при нагревании не стабилизируется ионами Са2+.
По мнению авторов, полученные ими данные указывают на то, что основная роль Са2+ в стабилизации нативного термолизина против тепловой денатурации заключается в защите области молекулы, находящейся вблизи одного или обоих одиночных участков связывания Са2+, от кооперативного коиформационного изме-
нения, которое может приводить к необратимой модификации фермента и утрате им термостабильности.
Благодаря первоклассным и детальным исследованиям термолизин стал наиболее полно охарактеризованным представителем термофильных ферментов. Важно отметить, что сам по себе этот белок не обладает никакими необычными структурными особенностями, которые могли бы объяснить его высокую термостабильность, за исключением его способности специфически связывать ноны Са2+ таким образом, что от этого зависит общая конформация белка. Очевидно, сам апофермент не является термостабильным (в отличие от апоферментов, входящих в состав внутриклеточных ферментов термофилов, например ГФДГ). Поэтому, вероятно, можно сделать окончательный вывод о том, что термостабильность термолизина определяется структурой участков связывания кальция и что два таких одиночных участка имеют наиболее решающее значение для обеспечения термостабильности фермента. Подобная система стабилизации не обнаружена у внутриклеточных ферментов, и пока не известно, является ли она общим механизмом для внеклеточных ферментов. Термолизин представляет собой уникальный объект для исследования механизмов термофилии на современном уровне наших знаний, но он не может служить идеальной моделью для изучения внутримолекулярных основ термостабильности ферментов.
Предыдущая << 1 .. 148 149 150 151 152 153 < 154 > 155 156 157 158 159 160 .. 267 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed