Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
входящих в исследуемую смесь. Таким образом, все бесчисленное множество
реакций, разработанных для анализа органических соединений, в принципе
пригодно для обнаружения с применением химических реакций.
3.7. Препаративное разделение
3.7.1. Введение
Как уже упоминалось во введении к этой книге, жидкостная хроматография
возникла и длительное время использовалась как препаративный метод. С
начала 60-х годов с появлением таких детекторов, которые можно подключать
к разделитель-
160 Глава 3
ной колонке, этот метод начал применяться и в аналитических целях.
На одной из последних выставок-продаж хроматографического
оборудования специалистам по аналитической химии был задан вопрос: "Если
вы проводите препаративное разделение методом ЖХ, какое количество
чистого вещества вы хотите получить?" Результаты этого опроса
представлены на рис. 3.34 в виде зависимости числа ответов (в процентах)
от количества образца, которое необходимо выделить. Согласно этим данным,
для 40% опрошенных количество менее 100 мг представляется приемлемым.
Большинство аналитиков считают, что это количество должно составлять
порядка нескольких сотен микрограмм. Как препаративный метод
хроматография имеет по сравнению с другими методами значительные
преимущества, заключающиеся в высокой селективности и эффективности, что
позволяет разделять даже самые сложные смеси за сравнительно короткое
время. По этим причинам данный метод весьма предпочтителен в тех случаях,
когда необходимо получить чистые вещества в количествах, соответствующих
указанному на рис. 3.34 диапазону.
К недостаткам хроматографии как препаративного метода следует отнести
тот факт, что степень загрузки хроматографических колонок очень
ограничена. В зависимости от растворимости молекул пробы в подвижной фазе
и параметров изотермы распределения количество вещества, которое можно
нанести на колонку, колеблется от 0,01 до 10 мг/г неподвижной фазы. Если
это значение превышено, наблюдается резкое снижение эффективности
колонки, выражающееся в увеличении высоты, эквивалентной теоретической
тарелке. Характер этой зависимости показан на рис. 3.35. Этот эффект
можно компенсировать, либо увеличивая размеры колонки [72], либо нанося
пробу в виде последовательных малых порций до тех пор, пока не будет
получено желаемое количество чистого вещества [73].
Масштабирование колонок для жидкостной хроматографии в отличие от
масштабирования колонок для газовой хроматографии можно выполнить без
потери эффективности разделения.
3.7.2. Области применения и условия разделения
В процессе практического развития препаративной жидкостной
хроматографии, которое проходило с учетом описываемого выше эффекта, был
разработан ряд различных систем, каждая из которых характеризуется
набором специфических условий, касающихся режима разделения образца и
эффективности разделения. Продемонстрировать эту ситуацию можно графиком,
Масса пробы
Рис. 3.34. Результаты опроса: процент исследователей, желающих разделить
определенный объем пробы.
Рис. 3.35. Зависимость эффективности разделения от вводимого в колонку
объема пробы.
11-1489
162 Глава 3
Масса провы
Рис. 3.36. Области применения препаративной жидкостной хроматографии.
напоминающим рис. 3.35. На рис. 3.36, который еще раз изображает
зависимость эффективности разделения (показанную в виде хроматограмм) от
количества нанесенного образца, можно выделить три следующие области.
Область А - это область классической колоночной хроматографии. Процесс
разделения в этом случае достаточно прост. Количество разделяемой пробы
составляет от 100 мг до нескольких грамм. Разделение обычно проводят в
одну стадию. Этот метод, как правило, используют для отделения целевого
продукта от нежелательных побочных продуктов или для предварительного
фракционирования групп соединений, например содержащихся в растительном
экстракте. Разделение осуществляется на обычных стеклянных колонках
внутренним диаметром от 2 до 10 см, заполненных сефадексом или
силикагелем - неподвижная фаза. Подвижная фаза протекает через колонку
под действием силы тяжести или же прокачивается насосом низкого давления.
Система автоматического контроля отсутствует, элю-ат собирается без
дополнительной проверки коллектором фракций, фракции в дальнейшем
исследуются методами тонкослойной хроматографии, спектроскопии или
визуально. Такие системы отличаются простотой конструкции и дешевизной,
обслуживать их несложно. Однако их разрешающая способность ограничена.
Аппаратура 163
Ввод неподвижной
Поток извытка растворителя
Поршень нижнем положении
Поршень в верхнем положении
Поршень удерживается в верхнем положении
Удаление насадки
Рис. 3.37. Система Chromatospac Ргер 100 (с разрешения Jobin Yvon Co.).
Интересный подход к проблеме увеличения разрешающей способности
колонок этого типа предложен фирмой Jobin Yvon Со. в разработанной ею
