Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Более того, поскольку принципы обнаружения требуют наличия проводящих
жидкостей, это в свою очередь ограничивает диапазон применимости таких
хроматографических методов, в которых используются водные или буферные
подвижные фазы.
В табл. 3.4 приведен список наиболее важных классов соединений и
указан соответствующий им диапазон потенциалов окисления/восстановления.
Подробные литературные источники, касающиеся конкретных областей
применения, имеются у большинства фирм, выпускающих такие приборы
(Bioanalyti-cal Systems, Methrom).
Следует сделать одно общее замечание, касающееся применения данного
метода обнаружения. Хотя возможности метода ограничены, амперометрические
и кулонометрические детекторы предпочтительны во всех тех случаях, когда
приходится работать с классом соединений, способных к электрохими-
152 Глава 3
Таблица 3.4. Список электроактивных соединений, анализируемых методом
ВЭЖХ с обнаружением электрохимическими методами
Анализируемое Потенциал , В
---2 0 + 1 + 2
Фенолы
Катехины/дегидро -
ксииидолы
Ароматические амн-
ны
Меркаптаны/суль-
фнды
Пурииы
Фенотиазины
Ннтропронзводные
Нитрозопроизводные
Хиноны
Имины, семикарбазн-
Ды
ческим превращениям. Это объясняется высокой селективностью
электрохимических детекторов, их чувствительностью и низким пределом
обнаружения.
3.6.6. Обнаружение с использованием химических реакций
З.6.6.1. Введение. Как было показано в предыдущих разделах, обнаружение
компонентов элюируемой пробы возможно только в том случае, если
компоненты обладают какими-либо свойствами, позволяющими отличить их от
подвижной фазы, или если в результате их присутствия свойства подвижной
фазы меняются. Однако эти требования значительно ограничивают возможности
обнаружения растворенных веществ. Неспецифические детекторы, например
рефрактометрические, имеют ограниченную обнаруживающую способность, в то
время как специфические детекторы реагируют на растворенные соединения
только в том случае, если последние содержат хромофор или электрофор.
Таким образом, обнаружение малых концентраций соединений, не
обладающих ни хромофорными, ни электрофорнымн свойствами, представляет
собой сложную задачу.
Обнаружение поглощающих свет соединений также оказывается трудным при
анализе проб сложного состава, например проб, получаемых при
биологических или медицинских исследованиях. В этом случае необходима
высокая селективность обнаружения.
Аппаратура 153
Таблица 3.5. Основные особенности пред- и послеколоночной модификации
Предколоночная модификация
Послеколоночная модификация
Условия
реакции
Производ-
ные
Можно подобрать оптимальные условия проведения химической реакции Время
реакции не ограничено
Степень превращения должна составлять 100% Хроматографическое разделение
затруднено, так как производные "более" идентичны
Возможно образование диастереоизомеров. Будут элюироваться отдельными
пиками. Возможно появление ложных пнков Простота процедуры
Реагенты и реакции должны быть совместимы с подвижной фазой Время реакции
определяется достигнутым разделением Степень превращения должна быть
воспроизводимой Хроматографическое разделение не нарушается модифи:
кацией
Ложные пики и пики изомеров перекрываются
Трудно проводить рутинные анализы
В свете сказанного обнаружение с использованием химических реакций
предоставляет широкие возможности. Основу этого метода составляет
введение хромофорных или электро-форных групп путем химической реакции
(модификация). Разумеется, такую модификацию можно выполнить и до
проведения хроматографического разделения, т. е. можно провести
"предколоночную модификацию". При проведении послеколоночной модификации
элюат смешивается с реагентом в потоке, и растворенные соединения
образуют поглощающие свет или флуоресцентные производные. Если это
необходимо, потоки реагента и подвижной фазы интенсивно перемешиваются,
нагреваются и (или) задерживаются в промежуточном объеме для полного
завершения медленных реакций.
Непосредственно после окончания реакции реакционная смесь поступает в
детектор, чаще всего флуориметрический.
Сравнение пред- и послеколоночной модификации (табл. 3.5) показывает
преимущества и недостатки обоих методов. Выбор того или иного метода
будет зависеть от конкретных условий.
3.6.6.2. Общие положения. После выхода из колонки (с) анализируемое
соединение (/) содержится в объеме (V), характеризующемся дисперсией
