Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Метионин (Met)
VII. Имннокислоты Пролин (Pro)
О-
NH
сн2 NHj-CH-COjH
С H2-SH
CH,-S -
.nh,-
ch-co2h
XH,
(CH2)2-SCH3
.-CH-COjH
Qc
2,38; 9,39
5,88
1,71;
8,33 (сульфгид-рильная группа); 10,78 (а-амнио-)
1,65;
2,26
(карбоксилы);
7,85;
9,85
(аминогруппы) 2,28; 9,21
1,99; 10,60
5,02
5,05
5,75
6,10
нокислот, сложности возникают главным образом потому, что аминокислоты с
заряженными боковыми цепями высокополяр-ны. Другая проблема - следствие
низких коэффициентов поглощения аминокислот в УФ-области. В принципе для
обнаружения аминокислот можно использовать их поглощение в УФ-области при
малых длинах волн, например при 200 нм, но малые коэффициенты поглощения
карбоксильных групп вынуждают применять только сверхчистые растворители.
Чтобы преодолеть эти трудности, приходится прибегать к пред- или
послеколоночной модификации аминокислот. В первом случае можно получать
гидрофобные производные аминокислоты, которые значительно проще разделить
методом ВЭЖХ. Кроме того, можно обрабатывать пробу модифицирующими
реагентами, которые дают с аминокислотами производные со значительно
более высокими коэффициентами поглощения. После-колоночная модификация в
качестве метода обнаружения аминокислот используется по схеме,
аналогичной применяемой в
Аминокислоты, пептиды, белки 175
классическом аминокислотном анализаторе. К недостаткам метода
послеколоночной модификации следует отнести необходимость в
дополнительном, зачастую нестандартном оборудовании ч еще большее
уширение пиков.
4.1.2. Свободные аминокислоты
В последние 15 лет общепринятой методикой разделения свободных
аминокислот была ионообменная хроматография, описанная Спакманом и др.
[3], с применением послеколоночной модификации нингидрином,
флуорескамином или фталевым альдегидом с целью последующего обнаружения.
Относительно недавно было предпринято несколько попыток применить ВЭЖХ
для аминокислотного анализа, и свободные аминокислоты удалось успешно
разделить методами хроматографии на неподвижных фазах с химически
привитыми функциональными группами, например обращенных фазах,
аминофазах, а также методами ион-парной, лигандо- и ионообменной
хроматографии.
4.1.2.1. Хроматография на химически связанных фазах.
В фундаментальных исследованиях разделения аминокислот на неполярных
неподвижных фазах [4] описано разделение неполярных аминокислот на
обращенно-фазовых носителях в нзократических условиях. В качестве элюента
использовались водные буферные растворы с pH от 0,2 до 2,0, в которых
карбоксильные группы аминокислот находятся в основном в не-
диссоциированном состоянии, что приводит к увеличению времени
удерживания. Обнаружение проводилось при 200 нм. Как показали результаты
исследований, логарифм коэффициента емкости линейно зависит от числа
углеродных атомов в боковой цепи простых алкиламинокислот (рис. 4.1).
Вследствие высокой полярности гидрофильные аминокислоты весьма слабо
удерживаются гидрофобными неподвижными фазами, тем не менее их разделение
можно осуществить в результате введения в подвижную фазу ионогенных
поверхностно-активных соединений, например децилсульфата. Это так
называемая нон-парная хроматография, в процессе проведения которой
гидрофобный, но заряженный ион-парный реагент ассоциируется с
противоположно заряженной группой аминокислоты, что приводит к
образованию ион-парного комплекса, имеющего более высокий коэффициент
емкости, чем свободная аминокислота.
Другой пример ион-парной хроматографии аминокислот приведен в работе
[5]. На рис. 4.2 показано разделение всех аминокислот белкового
гидролизата, за исключением пары Glu/Gly.
176 Глава 4
Рис. 4.1. График зависимости логарифма коэффициента емкости от числа
атомов углерода в боковой цепи н-алкиламинокислот [4]. Неподвижная фаза:
лихросорб RP-18, 5 мкм; элюент: 0,5 М хлорная кислота или 0,1 М фосфатный
буфер, pH 2,1; температура: 70 °С.
Предел обнаружения в 3 нмоль отдельной аминокислоты достигается в
результате использования послеколоночной обработки содержащихся в элюате
аминокислот смесью фтале-вый альдегид/меркаптоэтанол, осуществляемой в
потоке. Аппаратура, схема которой представлена на рис. 4.3, может слу
жить примером дополнительного оборудования, необходимость в котором
возникает в связи с послеколоночной модификацией аминокислот.
Несколько иной подход к разделению гидрофильных аминокислот
предусматривает применение более полярной неподвижной фазы. Автор работы
[6] описал разделение свободных аминокислот на аминофазе: все
аминокислоты, присутствующие в белковом гидролизате, были разделены таким
способом всего за 30 мин. Элюирование велось в градиентном режиме смесью
ацетонитрил/фосфатный буфер при температуре 35 °С, обнаружение
