Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Наилучшей процедурой, позволяющей исключить присутствие ДИ-частиц или значительно уменьшить их содержание в маточной взвеси вируса, является неоднократное последовательное клонирование вируса (непосредственно от бляшки к бляшке) с последующим получением рабочей взвеси с высоким титром, содержащей вирусное потомство только из одной или нескольких бляшек [60, 146]. Но даже в этом случае ДИ-частицы могут присутствовать в рабочей взвеси в небольших (обычно приемлемых) количествах. Если взвесь, содержащую небольшое количество ДИ-частиц, использовать для пассирования без разведения, то при этом всегда (в независимых сериях пассажей) будут накапливаться ДИ-частицы одного и того же типа (типов) [60, 91]. Напротив, при использовании свободной от ДИ-частиц взвеси вируса в каждой серии независимых пассажей будут накапливаться свои ДИ-частицы, различающиеся по свойствам и размерам (рис. 6.2). В первом случае предсуществующие ДИ-частицы накапливаются и быстро начинают преобладать после пассирования без разведения. Во втором случае новые ДИ-частицы случайным образом возникают и накапливаются в каждой серии во время первого неразведенного пассажа [60, 91]. Благодаря этому мы имеем чувствительный тест для выявления очень низкого
Рис. 6.2. Простой тест для определения присутствия или отсутствия ДИ-частиц в препарате VSV. Анализ в сахарозном градиенте показывает случайное (вероятностное) образование ДИ-частиц различных размеров в препарате вируса, свободном от ДИ-частиц (А) и упорядоченную неслучайную амплификацию ДИ-частиц определенных размеров в препарате вируса, содержащем следовые количества ДИ-частиц (Б). Стрелкой указано положение полосы более крупного инфекционного вируса. Остальные полосы соответствуют различным ДИ-частицам. Вирусные частицы и ДИ-частицы очищали и анализировали после четырех независимых серий неразведенных пассажей из каждого препарата вируса. Приведены результаты только четвертых пассажей, так как до четвертого пассажа полосы ДИ-частиц не были видны. Вирус, использованный для начала каждой серии пассажей в А, взят прямо из бляшки после нескольких последовательных клонирований. Источник вируса, использованного для начала каждой серии пассажей в Б, — клонированный препарат с высоким титром, полученный размножением вируса, взятого из бляшки. Подробности анализа этого типа см. в работе [60].
по сравнению с вирусом количества ДИ-частиц и можем повторно получать ДИ-частицы одного или нескольких типов, а также получать и отбирать новые типы ДИ-частиц.
Пассирование без разведения способствует продукции ДИ-частиц просто потому, что при заражении вирусом с высокой множественностью почти каждая клетка, зараженная ДИ-части-цей, содержит также и инфекционный вирус-помощник, который поддерживает репликацию этой частицы. И наоборот, вирус при большом разведении или вирус, полученный прямо из бляшки, с чрезвычайно малой вероятностью попадает в ту же клетку, в которую попала ДИ-частица. После того как разведенный вирус пройдет несколько циклов репликации и охватит большой процент клеток в популяции, вероятность двойного заражения одной
и той же клетки как ДИ-частицей, так и вирусом-помощником возрастает; однако к этому времени во многих клетках происходит репликация стандартного вируса, и соотношение вируса и ДИ-частиц в конечном урожае будет высоким.
В связи с тем что в различных системах вирус — клетка скорость накопления ДИ-частиц значительно варьирует, степень загрязнения вирусных препаратов ДИ-частицами также сильно варьирует. Например, для получения детектируемого количества ДИ-частиц пикорнавирусов требуются десятки последовательных неразведенных пассажей [28, 108], в то время как клонированный вирус бешенства, полученный из бляшки, продуцирует большое количество ДИ-частиц во время первого неразведенного пассажа на клетках ВНК21 [60]. VSV при размножении на этих клетках образует большое количество ДИ-частиц в течение нескольких пассажей неразведенной взвеси клонированного вируса, а на клетках HeLa ДИ-частицы не обнаруживаются даже после 27 пассажей [60]. Каждая система вирус—клетка должна быть исследована отдельно, но в целом тенденция наиболее эффективного образования и накопления ДИ-частиц наблюдается для клеток, наиболее чувствительных к вирусу, дающих максимальные титры вируса.
Определение количества ДИ-частиц
Для определения количества ДИ-частиц используют ряд методов. Сюда входят очистка и прямое наблюдение полос ДИ- (и вирусных) частиц в сахарозном градиенте [72]; определение снижения урожая вируса в опытах на клеточном монослое [14]; подавление формирования инфекционных центров [155], вирус-специфического синтеза РНК [Ю], а также вызываемого вирусом разрушения клеток [107]; амплификационный анализ, основанный на измерении количества ДИ-частиц, накапливающихся при последовательных пассажах с вирусом-помощником; определение количества фокусов выживающих клеток, основанное на том, что ДИ-частицы защищают клетки, зараженные стандартным вирусом [82, 130, 156]. Определение фокусов выживающих клеток (негативных бляшек) для ДИ-частиц служит наиболее чувствительным тестом, так как каждая отдельная ДИ-частица защищает от разрушения островок клеток (при малой дозе введенного инфекционного вируса) (рис. 6.3). Метод был применен для вируса лимфоцитарного хориоменингита [72], .VSV [33] и вируса бешенства [54]. Однако этот метод годится далеко не для всех систем вирус — клетка, так как ДИ-частицы должны при этом подавлять вызываемое вирусом разрушение клеток, а также быстро накапливаться и распространяться на соседние клетки, чтобы дать возможность формироваться колониям выживающих клеток.
