Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Большинство стероидных гормонов находится в крови главным образом, в форме сульфатов или глюкуронидов, а эти конъюгаты не дают реакции при использовании методов, предназначенных для анализа свободных стероидов. На поздних стадиях беременности в такой конъюгированной форме находится, например, более 90% эстриола плазмы. При подготовке к анализу методов связывания конъюгаты стероидов гидролизуют таким же способом, как и в классическом флуо-риметрическом методе или в методе газовой хроматографии. Сначала образец обрабатывают сильной кислотой1 или гидролитическим ферментом2, а затем экстрагируют освобождающийся стероид и определяют его количество. Преимущество ферментативного метода гидролиза заключается в том, что при достаточно высоком содержании гормона конечный этап экстракции можно не проводить. Использование радио-иммунологического метода, предназначенного для анализа конъюгатов как таковых (например, эстрнол-16-глюкурони-дов), позволяет избежать гидролиза. В принципе такой подход представляется весьма привлекательным, поскольку он избавляет от этапа, который отнимает много времени и является потенциальным источником ошибок (Collins, Hennam, 1976).
Образование комплексов со связывающими белками плазмы можно наглядно проиллюстрировать на примере стероидов, а также гормонов щитовидной железы. Эндогенный связывающий агент, присутствующий обычно в высоких концентрациях, будет конкурировать за меченый и немеченый лиганд
1 Preedy, Aitken (1961); 5—15 мл плазмы разбавляют до 100 мл водой, добавляют 17,5 мл концентрированной НС1 и кнпятит с обратным холодильником в течение 45 мин.
2 Экстракт из Helix pomatia, содержащий глюкуронндазу и сульфа-тазу (Calbiochem).
v свюьюающигг аге#/п
До&аеле/глыа с&*зб/&аюи<ии а ген/гг
°*б °
• Эндогенный лиган9
* Меченый лигам#
Рис. 6.4. Схема, иллюстрирующая необходимость стадии экстракции при наличии в образце эндогенного связывающего агента. Последний конкурирует за эндогенный н меченый лигаид со связывающим агентом, применяемым при аналнзеа в связи с чем получаются неправильные результаты.
со связывающим агентом, применяемым при анализе. Таким образом, с одной стороны, большая часть эндогенного лиганда окажется связанной и недоступной для анализа, а, с другой стороны, эндогенный связывающий агент будет конкурировать за меченый лиганд. Вследствие этих причин и в зависимости от природы связывающего агента (т. е. в зависимости от того, является ли он природным связыващим агентом или антителом), а также метода разделения конечный результат будет занижен или завышен и в любом случае не будет отражать истинную концентрацию гормона в крови (рис. 6.4). При анализе стероидов проблему эндогенного связывания можно решить путем предварительной экстракции; так, при помощи эфира можно избирательно экстрагировать неконъ-югированные эстрогены, в том числе связанные с белками. Аналогичный прием можно использовать в случае тиреоид-ных гормонов. Наряду с этим может быть использован агент, который вызывает диссоциацию, являясь при этом достаточно активным для ингибирования реакции между эндогенным связывающим агентом и лигандом, но недостаточно активным для того, чтобы влиять на реакцию антиген — антитело. Прекрасным примером может служить использование с этой целью органического детергента — анилинонафталинсульфо-новой кислоты (АНС) в конечной концентрации приблизительно 1 мг/мл в радиоиммунологическом методе анализа тироксина (Chopra, 1972). Это соединение может добавляться в процессе анализа вместе с каким-либо из реагентов, например с меченым лигандом, что позволяет получить удобную для работы систему, не требующую предварительной подготовки образца.
Особым случаем отделения лиганда от эндогенного связы-рдощего белрэ Я§ляет?я анализ свободных гормонов. Задача
в этом случае состоит в том, чтобы измерить содержание в крови гормона, не связанного с белком, т. е. только той его части, которая считается ответственной за биологическую активность. В принципе при таком анализе исключается неопределенность, которая возможна при определении общей концентрации гормона в связи с вариациями количества эндогенного связывающего белка. Так, у людей, принимающих per os контрацептивные средства, содержащие эстрогены, в крови обнаруживается повышенное содержание глобулина, связывающего тироксин; общая концентрация тироксина соответственно также повышена, однако концентрация несвязанного гормона остается неизменной. Определить содержание несвязанного гормона, обладающего биологической активностью, можно путем диализа образца сыворотки с последующим определением в диализате концентрации гормона или распределения в этой системе меченого гормона.
Последним примером, показывающим, что эндогенный связывающий агент может влиять на результаты количественного определения, служит анализ образцов, содержащих антитела к лиганду. Такую ситуацию можно вызвать у животных — как результат преднамеренной иммунизации, а также у людей — как нежелательный побочный эффект лечения. Так, например, после продолжительного лечения гормонами, полученными из природных источников (такими, например, как гормон роста, инсулин, экстракты задней доли гипофиза), у большинства больных образуются антитела, специфичные по отношению к этим гормонам. С точки зрения анализа эндогенного лиганда этот факт может иметь два следствия: во-первых, благодаря связыванию меченого лиганда антителами, присутствующими в высокой концентрации, при анализе будут получаться очень низкие или даже нулевые величины (см. рис. 6.4), а, во-вторых, в связи с наличием в крови антител, нередко блокирующих биологическое действие гормона, общая концентрация гормона в крови может в действительности быть исключительно высокой. Для определения общего количества гормона в этих условиях необходима предварительная экстракция. Практически с этой целью может быть использован один из рассмотренных выше способов, выбор которого зависит от природы анализируемого вещества. Существует более универсальный способ, который применим в принципе к любому веществу, но используется редко; этот способ состоит в том, что с помощью кислоты вызывают диссоциацию комплекса антиген — антитело, а затем разделяют свободные антитела и антиген методом гедь-
