Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Экстракция с целью концентрирования получила наиболее широкое применение при радиоиммунологическом анализе небольших пептидных гормонов. Лучше всего перечисленным выше требованиям соответствуют методы экстракции, основанные на добавлении адсорбента в пробирку, хотя с успехом используются также и другие методы и, в частности, метод ионообменной хроматографии (Chard, 1971).
В качестве адсорбентов обычно используют мелкозернистые силикаты (такие, например, как фуллерова земля, стеклянные бусины, кремниевая кислота). Для всех этих материалов характерна большая общая поверхность при сравнительно
небольшом весе. Природа процесса адсорбции остается пока неясной.
Большинство систем, применяемых для адсорбции, основано на уже описанной в литературе методике (см. табл. 6.1).
'¦}¦ Таблица 6.1
Концентрирование путем экстракции с использованием мелкозернистого адсорбента
(Модифицированный радиоиммунологический метод анализа АКТГ; Rees et al., 1971)
1. Добавляют 50 мг стеклянных бусин Vycor glass (Corning Glass) в пластиковые пробирки, содержащие по 2,5 мл плазмы
2. Закрывают пробирки и вращают их в течение 30 мии с целью перемешивания
3. Центрифугируют в течение 5 мин при 2000 g; отсасывают и отбрасывают надосадочную жидкость
4. Промывают осадок 3 мл деионизованной воды и 2 мл 1 М НС1; промывные воды отбрасывают
5. Элюируют АКТГ путем перемешивания осадка с 2 мл 60%-ного (объем/объем) ацетона в деионизованной воде
6. Центрифугируют, осторожно отбирают надосадочную жидкость и переносят ее при помощи пастеровской пипетки (используя каждый раз отдельную пипетку) в пластиковые пробирки
7. Помещают пробирку в песчаную или в водяную баню и упариват жидкость досуха при 50 °С под слабой струей азота, не содержащего кислорода
8. Растворяют сухой остаток в 0,5 мл буфера, используемого для разбавления
Примечание. Описанная методика предназначена специально для анализа АКТГ,
однако с небольшими изменениями может быть использована также при количественном определении целого ряда небольших пептидных гормонов.
Тем не менее каждый раз методику необходимо тщательно проверять, поскольку в разных лабораториях при использовании одинаковых на первый взгляд материалов могут получаться совершенно разные результаты. При налаживании нового метода, предназначенного для анализа еще не изученного лиганда, следует проверить несколько адсорбентов, например флоризил, фуллерову землю и различные типы стеклянных бусин типа Spherosils и Vycor (Corning). Наряду с этим следует подобрать условия для процесса адсорбции (время, температуру, pH, ионную силу и количество адсорбента), а также растворители (например, водный ацетон или этанол) для элюции. Начальные стадии исследования значительно упрощаются при использовании в качестве маркера меченного изотопом лиганда, а в качестве экстрагируемой среды — буферного раствора вместо биологической жидкости. Следует, однако, помнить, что меченый лиганд может вести себя иначе, чем немеченый, а полнота извлечения — варьировать в зависимости от состава жидкости. Из сказанного следует,
что окончательно оценить способ экстракции можно лишь по проценту извлечения интактного немеченого лиганда из свежей цельной крови или мочи.
Подобрав в предварительных опытах подходящий метод экстракции, следует детально исследовать все характеристики системы, уделяя особое внимание полноте извлечения, воспроизводимости, идентичности экстрагированного и неэкст-рагированного лиганда и проблеме контроля (blank).
Полнота извлечения. Полноту извлечения определяют путем нескольких повторных экстракций и выражают в процентах от фиксированного количества лиганда. В идеале полнота извлечения должна составлять 100%, однако не следует во что бы то ни стало добиваться этой величины; простая и воспроизводимая методика с полнотой извлечения приблизительно 60% является обычно предпочтительнее, чем сложная процедура, которая при 90%-ной полноте извлечения дает разброс результатов. Полноту извлечения всегда следует определять для различных концентраций лиганда, выбирая их с таким расчетом, чтобы покрыть весь интервал концентраций, который может иметь место в биологических жидкостях. Если в этом интервале метод дает большой разброс, следует от него отказаться.
Воспроизводимость. Как и в других ситуациях, воспроизводимость следует выражать в виде коэффициента, характеризующего разброс при повторных определениях в одном и том же образце. Чтобы полученная величина была достоверной, требуется не менее двадцати определений; кроме того, она должна быть рассчитана на основании результатов, полученных разными операторами и в разное время. Необходимо также установить, насколько различается полнота извлечения при двух разных экстракциях, причем в данном случае слово «насколько» относится к результату статистической обработки (показатель t по Стьюденту), а не к простому определению на глаз. Если разница между определениями незначительна, то нет надобности проверять полноту извлечения при каждом анализе, что заметно экономит время и материалы. Если же эта разница велика, то необходимо провести дополнительную проверку полноты извлечения.
