Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Лимитирующие количества меченого лиганда можно установить либо на основании теоретического анализа (см. разд. 1.10), либо экспериментальным путем. Оба эти подхода приводят к следующему выводу: при любых заданных условиях (таких, как сродство и концентрация связывающего агента, время инкубации и т. д.) существует лимитирующая концентрация меченого лиганда, дальнейшее уменьшение её уже не вызывает сильных изменений в положении калибровочной кривой или в чувствительности анализа.
Это положение иллюстрируется теоретическим примером, показанным на рис. 8.2. Практически нужную концентрацию меченого лиганда подбирают следующим образом: 1) выбирают концентрацию меченого лиганда, приблизительно эквивалентную тому наименьшему количеству немеченого лйГан-да, которое, предполагается определить при помощи данного метода анализа; 2) строят кривую разведения связывающего агента и выбирают такую концентрацию последнего, при которой связываются приблизительно 50% меченого лиганда; 3) строят калибровочные кривые, охватывающие широкий интервал концентраций немеченого лиганда, используя при этом найденную, согласно п.2, концентрацию связывающего агента и три различные концентрации меченого лиганда: одна из этнх концентраций соответствует указанной в п. 1, другая составляет одну десятую от нее, а третья должна быть в 10 раз больше первой. Если антисыворотка обладает достаточным сродством, позволяющим проводить анализ в
выбранном интервале концентраций, то в результате указанных определений получают три калибровочных кривых, которые можно интерпретировать подобно тому, как это показано на рис. 8.2. Описаны также другие экспериментальные подходы к выбору наименьшей концентрации меченого лиганда: так, например, строят серию кривых разведения связывающего агента, используя различные количества меченого лиганда или смесь меченого и немеченого лиганда, или же подбирают фиксированную концентрацию стандарта в предполагаемых пределах чувствительности метода, а затем, используя разные количества меченого лиганда, сравнивают полученные результаты с величинами нулевого стандарта.
Конкретные детали используемого подхода здесь менее важны, чем понимание основных-принципов.
От выбора оптимального количества меченого лиганда зависит приготовление его исходного раствора. Практически следует исходить из такого количества меченого лиганда, чтобы общее число импульсов на пробу составляло не более 10 000 в минуту. Если минимальное количество меченого лиганда, которое диктуется описанными выше опытами, дает значительно большее число импульсов, то следует снизить удельную радиоактивность исходного препарата, что дает целый ряд преимуществ (меньше опасность повреждения, проще условия работы). В равной степени описанные выше эксперименты могут указывать на необходимость повышения удельной радиоактивности меченого лиганда.
8.2.2. Уменьшение количеотва связывающего агента
По мере уменьшения количества связывающего агента чувствительность анализа будет повышаться. Это положение иллюстрирует рис. 8.3, на котором показаны широкие преде-
Хонцен/прация стандарта
Рис. 8.2. Повышение чувствительности анализа путем уменьшения количества меченого ли* ганда (теоретический пример; см. разд. 1.9 и и 1.10). Заметим» что по достижении некоторого предела дальнейшее уменьшение концентрации меченого лнгаида (в данном случае при концентрациях меньше 0.01 относительной единицы) не вызывает изменения характеристик анализа. /, IIt III — количества меченого лиганда (0,1, 0,01 и 0,001 относительной единицы соответственно). К—10* концентрация связывающего агента 0,13.
Домечены# антиген, моль
Рас. 8.3. Повышение чувствительности радиоиммунологического анализа путем уменьшения количества антитела (теоретический пример; см. разд. 1.9 и 1.10). Заметан. что по мере уменьшения количества антитела чувствительность постепенно повышается, одаако в коаечном счете чувствательность лимитируется точностью определения в отдельных точках.
Средня* еелитна -и доверительный интервал &лянулевого стандарта
Средняя величина и доверительный интервал для первой тои/ги, отливающейся от нулеввгв станавр/тг
. Концентрация стандарта
Рас. 8.4. Теоретический пример, показывающий, что при использовании иазкой кои-пеьтрапии связывающего агента (10% свяаывання в нулевом стандарте) очень чувствительный иа первый взгляд метод анализа в действательности является значительно менее чувствительным по прачиие широкого доверительного интервала цля отдельных
точек.
лы, в которых варьируют получаемые таким путем результаты. Рассмотрение простого теоретического примера подобного типа позволяет предположить, что для возможного повышения чувствительности почти не существует пределов. Однако в действительности повышение чувствительности ‘ограничено точностью метода анализа. Возьмем для примера кривую, для которой величина нулевого стандарта составляет всего 10%; когда эта кривая построена в масштабе, показанном на рис. 8.4, то на первый взгляд может показаться, что в данном случае метод обладает исключительно высокой чувствительностью. Но если принять во внимание доверительные интервалы для параллельных определений, становится очевидным, что первая точка, достоверно отличающаяся от нулевого стандарта, приходится приблизительно иа середину кривой. Таким образом, добиваясь повышения чувствительности за счет уменьшения количества связывающего агента, всегда следует учитывать необходимость компромисса между теоретически возможной чувствительностью и воспроизводимостью при параллельных определениях. Это важное положение часто н е большим изяществом подчеркивал Экинс (Ekins, 1974). Чисто эмпирически установлено, что уменьшение количества связывающего агента до такой величины, при которой связывание в нулевом стандарте не превышает 20% от общего числа импульсов, часто оказывается неэффективным, поскольку любое кажущееся повышение чувствительности будет нивелироваться уменьшением точности.
