Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Идентичность экстрагированного и неэкстрагированного лиганда. Имеется две причины, по которым процесс экстракции может привести к отсутствию идентичности: во-первых, могут меняться физико-химические свойства лиганда и его способность связываться со связывающим агентом и, во-вторых, экстракт может содержать посторонние вещества, которые будут мешать взаимодействию связывающего агента с лигандом. Наиболее очевидным следствием отсутствия идентичности является отсутствие параллельности между кривы-
ми,.соответствующими различным степеням разбавления ие-экстрагированного лиганда (стандарта) и экстрагированного лиганда. Это явление может отражать некоторые, ио не все связывающие участки лиганда. Наряду с этим оно может быть обусловлено абсолютно неспецифическим влиянием на реакцию, как это показано на рис. 6.2. Следует, однако, помнить, что наличие параллельности еще не гарантирует идентичность (см. также разд. 9.2.2). Так, например, частичное
повреждение единственного связывающего участка, приводящее к уменьшению сродства между связывающим агентом и лигандом, может давать заниженные величины количества экстрагированного лиганда, но параллельность при этом будет сохраняться. Точно так же нет оснований считать, что помехи со стороны абсолютно неспецифических факторов всегда должны приводить к нарушению параллельности типа того, что показано на рис. 6.2. Даже при наличии кажущейся параллельности между .экстрактом и стандартом окончательно доказать идентичность можно только при помощи эксперимента, в котором проводится раздельная экстракция для
125„
Парт
аргинин-вазонрессина, пг
'’Станет
Рве. 6.2. Появление неспецифической иеспецифичности в результате экстракции (адсорбция аргииии-вазопрессвва иа стеклянных бусах с последующей элюци-ей; см. таб 1,6.1) / —калибровочная кривая; // —ie нйиые разведения экстракта плазмы; ///—серийные разведения того же экстракта плазмы, который, однако» не был достаточно тщательно вейтрадтоваи (т. е. реакцвя антиген -антитело угнеталась в области кислых значений pH).
каждого разведения стандарта. По причинам, которые будут рассмотрены ниже, в подобных экспериментах следует использовать стандарты, добавленные к биологической жидкости (например, к плазме или моче), о которой известно, что она не содержит эндогенного лиганда.
Проблема контроля («blank»). Нередко экстракты биологической жидкости, заведомо не содержащей лиганда, дают положительные результаты при сравнении их со стандартами, приготовленными в простых водных буферных растворах. В некоторых случаях без труда можно обнаружить, что найденная величина контроля является артефактом: так, например, если интересующий нас лиганд представляет собой лекарственный препарат, то образцы, взятые от больных, которые не получали это лекарство, должны давать нулевые величины. В других случаях вопрос об идентификации не так прост, как это имеет место, например, при определении ба-
зального уровня эндогенного гормона. Образцы, не содержащие гормона, можно получить двумя путями — либо от больных, для которых точно известно, что данный гормон у них отсутствует из-за разрушения секретирующего его органа, либо путем соответствующей обработки образца адсорбентом, способным удалять этот гормон из образца. Однако ни тот, ни другой путь не является полностью удовлетворительным. Лишь в редких случаях можно быть уверенным в том, что у больного действительно отсутствует данный гормон; так, например, у некоторых больных после таких воздействий, которые должны были бы привести к полному разрушению гипофиза, в крови обнаруживают нормальную и даже повышенную концентрацию пролактина. Искусственное приготовление образца, не содержащего гормона, путем его удаления при помощи адсорбента (как это имеет место, например, при получении плазмы, не содержащей инсулина, путем ее обработки углем) может оказаться в ряде случаев весьма эффективным, однако никогда нельзя быть уверенным в том, что этот способ не дает вторичных эффектов, влияющих на другие компоненты жидкости, в связи с чем имеет место значительное и неспецифическое снижение величины контроля. Таким образом, никогда нельзя'с уверенностью сказать, отражает ли действительно величина контроля базальный уровень гормона или является артефактом. Для решения этого вопроса требуется ряд дополнительных исследований, в том числе таких, как анализ изменений, наблюдаемых в четко определенных физиологических условиях, или идентификация экстрагированного материала при помощи классических физикохимических методов.
6.2. Экстракция с целью очистки лиганда
Часто имеет место ситуация, когда чувствительность метода связывания ре является проблемой, однако имеющиеся методы анализа недостаточно специфичны, поэтому с их помощью нельзя надежно определить содержание'эндогенного лиганда. Такая ситуация может возникать по двум причинам — либо лиганд является представителем семейства близкородственных веществ, каждое из которых может в равной степени вступать в реакцию при проведении анализа, либо лиганд связан в биологической жидкости с другими веществами (такими, например, как связывающие белки) и не поддается поэтому определению.
