Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 65

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 100 >> Следующая

8.2.3. Увеяичеиие времени инкубации
Увеличение продолжительности инкубации само по себе не является средством повышения чувствительности и может давать скорее противоположный эффект. Однако этот прием часто используют при очень низких концентрациях реагентов, поскольку для достижения равновесия в этих условиях требуется значительное время. При условии установления максимальной чувствительности метода анализа общее время инкубации может достигать семи дней *.
1 Можно предположить, что в случае антител, обладающих высокой константой сродства К (т. е. характеризующихся большой величиной kt), равновесие должно достигаться быстро. Имеются, однако, доказательства того, что в случае поливалентных антигенов и антител крайне редкр возникает конформация, обеспечивающая термодинамически стабильное связывание (Barisas et al., 1977), и установление истинного равновесия в действительности может происходить очень медленно. Это обстоятельство объясняется тем, что подходящее значение свободной энергии может быть достигнуто только прн условии, если молекулы антитела, обладающие, как известно, высокой конформационной лабильностью, проходят через редко реализуемую конформацию.
Помимо возможности достигнуть равновесия при низких концентрациях реагентов, длительная инкубация не дает никаких преимуществ, обладая в то же время рядом недостатков. Во-первых, она не может реально обеспечить максимальную чувствительность анализа; более детально этот вопрос будет обсуждаться при рассмотрении неравновесных методов анализа. Во-вторых, по мере увеличения времени инкубации увеличивается возможность нарушения нативной структуры реагентов, в частности меченого лиганда, под действием других компонентов системы; так, например, белковые гормоны могут подвергаться действию протеолитических ферментов. По этой причине при увеличении времени инкубации часто наблюдается постепенное уменьшение связывания в нулевом стандарте, что, естественно, неблагоприятно сказывается на чувствительности. Наконец, длительный инкубационный период создает ряд технических трудностей: во-первых, для хранения большого числа пробирок с анализируемыми образцами требуется много места; во-вторых, возрастает вероятность спутать один образец с другим и, наконец, задерживается поступление результатов анализа к врачу. Поэтому при налаживании метода анализа необходимо сделать все для того, чтобы по возможности уменьшить время инкубации.
8.2.4. Уменьшение продолжительности инкубации — неравновесный метед анализа
Если останавливают реакцию путем разделения свободного и связанного лиганда раньше, чем достигнуто равновесие, то связывание в нулевом стандарте будет снижено, а кажущаяся чувствительность может повыситься. Получается эффект, сходный с тем, который имеет место при снижении концентрации антител; основное различие состоит только в том, что в данном случае эффект будет достигнут быстрее. Однако операция разделения требует определенного времени. Если оно составляет значительную часть общего времени, требующегося для анализа, то возможны существенные различия между первой и последней пробирками данной серии, поскольку в последней пробирке реакция успеет больше приблизиться к равновесию. Для того, чтобы можно было успешно пользоваться таким приемом, необходимо очень внимательно относиться к методическим деталям.
Возможность значительного уменьшения времени инкубации становится в настоящее время отличительной особенностью многих коммерческих наборов для радиоиммунологи-ческого анализа. Иногда эта цель достигается за счет уменьшения точности. Так, в инструкции к набору для радиоимму-нологического анализа гастрина имеются значительные от-
ступления от исходной методики, в частности, время инкубации уменьшено до 1,5—3 ч, тогда как на самом деле оно должно было бы составлять 24 ч (Gibson et al., 1977). Методы анализа, в которых период инкубации чрезмерно короткий, необходимо тщательно проверять с учетом сказанного выше.
Ниже рассматривается другой тип неравновесного метода анализа, в котором меченый лиганд добавляют не до, а после добавления связывающего агента.
8.2.5. Порядок добавления реагентов
Обычно в методах связывания реагенты добавляются в следующей последовательности: образец — меченый лиганд — связывающий агент. В этих условиях меченый и немеченый лиганд обладают одинаковой возможностью связываться со специфическими участками связывающего агента, в связи с чем систему сравнительно легко анализировать, исходя из представления об одинаковой вероятности связывания с обоими компонентами. Если же изменить порядок добавления меченого лиганда и связывающего агента (т. е. сначала добавлять к образцу связывающий агент, а затем уже меченый лиганд), тогда в конечном счете можно получить совсем другую калибровочную кривую и значительно более высокую чувствительность (Samols, Bilkus, 1963). Такой способ анализа носит название «метод позднего добавления меченого лиганда».
На рис. 8.5. приведен пример, иллюстрирующий влияние изменения порядка добавления связывающего агента и меченого лиганда. Этот пример чрезвычайно выразителен, однако во многих случаях, например при анализе небольших пептидных гормонов, изменение порядка добавления не дает сколько-нибудь значительного эффекта. Возможность использования подобного приема применительно к той или ииой системе следует устанавливать методом проб и ошибок.
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed