Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
6.3. Общие черты методов экстракции
Хотя стадия экстракции нашла широкое применение во многих общепринятых методах связывания, тем не менее она все же нежелательна. Во-первых, это всегда приводит к снижению точности, поскольку любой дополнительный этап увеличивает общую погрешность метода. Во-вторых, с экстракцией связана проблема иеспецифичности, которая с трудом поддается контролю. В-третьих, и это особенно важно, проведение экстракции сильно ограничивает число образцов, которое может проанализировать один оператор. В прямом радиоиммунологическом методе анализа, не требующем экстракции, добавление двух или трех реагентов к точно отмеренному объему образца занимает не более 20 с, тогда как любая из описанных в настоящей главе операций отнимает не менее 3—4 мин рабочего времени оператора. В результате пропускная способность может быть снижена со 100 или более образцов в день до десяти. ,
Все перечисленные выше причины свидетельствуют о том, что по возможности следует избегать стадии экстракции, стараясь использовать такие методы анализа, в которых в ней нет необходимости. Практически это указывает на желательность нахождения по возможности более эффективных связывающих агентов, в качестве которых в большинстве случаев могут служить антитела. В тех случаях, когда возникает проблема чувствительности, необходима антисыворотка с более высоким сродством, а в тех случаях, когда возникает проблема специфичности, требуется антисыворот-ка, обладающая более высокой специфичностью.
УСЛОВИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ— РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
Судя по литературе, посвященной методам связывания, на разработку все более сложных и изощренных способов расчета результатов анализа нередко затрачивается значительно больше усилий, чем на решение куда более важных проблем: усовершенствование методик и разработку системы контроля качества анализа. В настоящей главе рассматриваются простейшие способы расчета результатов, а также некоторые более сложные методы преобразования данных, позволяющие получать калибровочную кривую в форме прямой линии, после чего приводится описание счетно-решающих устройств, позволяющих производить все требуемые расчеты.
7.1. Расчет результатов путем простей экстраполяции ет руки
В настоящее время повсюду в мире расчет результатов, полученных при применении методов связывания, производится практически вручную. Точки, соответствующие стандарту, наносят на график, используя одну из описанных в разд. 1.6 систем координат, после чего либо соединяют их отрезками прямой, либо (чаще) вычерчивают от руки плавную кривую, которая, на взгляд оператора, лучше всего объединяет полученные точки («линия . наилучшего соответствия»). Тот, кто не обладает достаточно твердой рукой, может воспользоваться лекалом. При анализе неизвестного образца отмечают на кривой точку, соответствующую найденной для этого образца величине отношения между связанным и свободным меченым лигандом, и находят по оси абсцисс концентрацию стандарта (см. рис. 1.4), соответствующую этой величине! Если проводится экстракция, то в найденную величину вводят соответствующую поправку.
Хотя описанный способ применяется очень широко, тем не меиее он обладает рядом недостатков. Первый из них кажется способа построения самой калибровочной кривой,
Простое соединение точек прямолинейными отрезками часто дает неправильную калибровочную кривую, которая, очевидно, не отражает истинную ситуацию и на ход которой влияют ошибки, допущенные при получении отдельных точек. Применять такой метод не рекомендуется. Соединение точек на глаз плавной «линией наилучшего соответствия» также таит в себе опасность, поскольку эта операция является в значительной мере субъективной. И все-таки возможности глаза и мозга человека часто недооцениваются нами, поскольку известно, что конечный результат, полученный вручную, нередко оказывается более точным по сравнению с тем, который получают при помощи различных счетных устройств (за исключением тех случаев, когда используют наиболее совершенные электронные компьютеры). На глаз можно обнаружить, в частности, и затем исключить случайно попавшие, ошибочные точки и вручную построить сложную в математическом отношении калибровочную кривую.
Вторым и значительно более существенным недостатком ручного способа построения кривой и отсчета результатов является вероятность ошибок. К числу последних относится так называемая прямая ошибка, состощая в том, что отсчет вдоль одной из осей координат делается неправильно. Ошибка такого рода встречается удивительно часто, особенно в тех случаях, когда одновременно приходится определять много величии. Другая ошибка связана с привычкой многих операторов округлять найденные величины до ближайшего целого числа. Все эти проблемы, связанные с ручным способом построения калибровочной кривой, могут служить убедительным аргументом в пользу применения счетно-решающих устройств.
7.2. Линеаризация калибревочной кривой
Если бы в методах связывания существовала линейная зависимость величины ответа от концентрации, то это позволило бы избавиться от многих проблем, в том числе от субъективности при вычерчивании калибровочной кривой. Во многих случаях этого можно добиться путем соответствующей обработки данных (см. разд. 1.6). Чаще всего с этой целью проводят преобразование, известное под названием «logit», впервые предложенное Родбардом в 1970 г. и получившее с тех пор широкое распространение. Величина logit рассчитывается по следующей формуле:
