Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Метод гомогенизации и осаждения. К суточной порции мокроты добавляют
равный рбъем 1%раствора едкого натра (или антиформина) для гомогенизации,
флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10-15
мин После центрифугирования и нейтрализации кислотой из осадка готовят
мазки и окрашивают по Цилю - Нельсену.
Метод флотации. Мокроту гомогенизируют и прогревают при 55°С в течение 30
мин на водяной бане. Затем добавляют 1-2 мл ксилола, дистиллированную
воду, повторно встряхивают в течение 10 мин и отстаивают 20 мин при
комнатной температуре. На поверхности образуется пена, состоящая из
всплывших капелек ксилола с адсорбированными микробами. Пипеткой или
петлей из пенообразного слоя готовят мазок, несколько раз наслаивая
материал на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обезжиривают
эфиром, фиксируют нагреванием и окрашивают по Цилю-Нельсену.
Применение люминесцентной микроскопии повышает число находок микобактерий
туберкулеза в патологическом материале.
Микроскопическое исследование является ориентировочным и позволяет судить
лишь о наличии кислотоустойчивых бактерий в материале без определения
видовой и типовой принадлежности.
Бактериологическое исследование. Для посева используют предварительно
обработанный Na3P04 исследуемый материал; необработанный материал
непосредственно перед посевом в течение нескольких минут подвергают
действию 10% серной кислоты или 4 - 6% раствора едкого натра для
освобождения
от сопутствующей микрофлоры, затем тщательно встряхивают и
центрифугируют. Осадок нейтрализуют и засевают на несколько пробирок со
средой Левенштейна - Иенсена или другими специальными средами. Среду
Левенштейна - Иенсена готовят из суспензии свежих яиц, картофельной муки,
глицерина, аспарагина, КН2Р04, сульфата и цитрата магния и малахитового
зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85°С в течение 45
мин. Посевы инкубируют при 37°С 4 - 6 нед и более, так как микобактерии
туберкулеза размножаются очень медленно, особенно в первых генерациях.
Культуры этих микобактерий имеют вид сероватого или светло-кремового
морщинистого или крошкообразного сухого налета (рис. 70).
При идентификации выделенной культуры микобактерий туберкулеза и
дифференциации ее от потенциально-патогенных микобактерий учитывают
морфологические и тинкториаль-ные особенности, характер и скорость роста
на питательных средах, биохимические свойства и вирулентность для
лабораторных животных. Из биохимических свойств чаще всего определяют
способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту
(ниациновая проба Конно). Это один из важных признаков, с помощью
которого удается отличить Mycobacterium tuberculosis, хорошо
синтезирующие никотиновую кислоту, от палочек М. bovis, образующих ее в
минимальных количествах.
Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной
среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5% раствора хлорамина. При
наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для
нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирке добавляют 3-
5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.
Для ускорения диагностики используют метод микрокультур Прайса. На
нескольких предметных стеклах (ближе к одному концу) делают толстые мазки
из исследуемого материала. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут
2-6% серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с
гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4 - 1:8 и ставят в
термостат. Через 7 - 14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат,
окрашивают по Цилю - Нельсону и микроскопируют (рис. 71) -вирулентные
штампы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов или кос (корд-фактор).
Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к антибиотикам и
химиотерапевтическим препаратам проводят
167
методом серийных разведений. С этой целью по ОД мл взвеси микобактерий
туберкулеза засевают в пробирки со средой Левенштейна - Иенсена,
содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов первого и
второго ряда: 5, 10, 50 мкг/мл стрептомицина; 5, 10, 50, мкг/мл ПАСК; 1,
5, 10, 25 мкг/мл тубазида; 30 мкг/мл циклосерина и этионамида. Учитывают
результаты на 12 -21-й день инкубации. Клинические границы устойчивости
микобактерий туберкулеза: стрептомицин - 5 мкг/мл, ПАСК-10 мкг/мл,
тубазид - 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид - 30 мкг/мл.
Биопроба. Применяется при первичной диагностике с целью выделения чистой
культуры микобактерий туберкулеза из органов животного, зараженного
исследуемым материалом, а также для определения вирулентности этих
микобактерий. Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для
освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно в
количестве 2-3 мл морской свинке с отрицательной туберкулиновой реакцией.
Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и
микроскопическое исследование органов и делают посевы. М. tuberculosis
