Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Процесс синтеза РНК, катализируемый РНК-полимеразой, делится на четыре стадии: 1) присоединение энзима к матрице; 2) инициация синтеза; 3) наращивание синтезируемой цепи РНК — элонгация; 4) завершение синтеза РНК — терминация.
Первая стадия обусловлена в основном ионным взаимодействием РНК-полимеразы с ограниченным числом участков ДНК-матрицы. Доля участков нативной, биспиральной ДНК, способных связывать полный энзим, невелика. РНК-полимераза «покрывает», по-видимому, не более 5% длины среднего цистрона ДНК, причем связывание идет только с одной из цепочек биспиральной молекулы. Есть основания полагать, что избирательность связывания обусловлена определенным набором нуклеотидов в соответствующих участках ДНК, в частности наличием там пиримидиновых блоков, а возможно, и строго определенной последовательностью оснований в таких блоках. Избирательность присоединения энзима становится еще более очевидной, если учесть, что связывающие энзим участки обладают неодинаковым сродством к РНК-по-лимеразе. Часть из них, видимо, более специфичные, связывают ее прочнее, другая часть образует неустойчивые комплексы. Пока еще недостаточно данных для утверждения, что прочно связывающие энзим участки нативной ДНК представлены только промоторами, с которых начинается считывание генов, однако высокая избирательность присоединения полной РНК-полимеразы очевидна. Неясно, как именно сочетается избирательность связывания с ионным характером взаимодействия энзим — ДНК, ибо при ионной силе выше 0,3 наступает полная диссоциация комплекса. Связывание обратимо также при физиологических значениях ионной силы, хотя равновесие при этом смещено в сторону образования комплекса. Видимо, значительную роль в связывании энзима, помимо определенного набора оснований, играют фосфатные группы ДНК. РНК-полимераза— «двуликий» белок в том отношении,
что она способна взаимодействовать как с полианионами, так и с поликатионами. При физиологических значениях pH и ионной силы как ДНК, так и энзим в целом несут отрицательные заряды и в то же время в обоих полимерах существуют группы, обладающие высоким сродством друг к другу.
Мы уже указывали, что наличие ст-фактора не обязательно для связывания РНК-полимеразы с ДНК. Однако прочность связи энзима именно с промоторными участками резко возрастает при наличии сг-фактора, и, только присоединив последний, РНК-полимераза меняет конформацию и становится высокоактивной на последующих стадиях процесса.
Важно подчеркнуть, что при денатурации ДНК описанная выше избирательность связывания РНК-полимеразы утрачивается как в отношении выбора определенного участка цепи, так и выбора только одной из комплементарных цепей. Иначе говоря, на одноцепочечной ДНК идет беспорядочный синтез РНК: ни исходные точки процесса, ни размер образующихся РНК не определены жестко.
Асимметричный синтез РНК на одной из цепей нативной ДНК нарушается не только при денатурации последней, но и при незначительных нарушениях нативности РНК-полимеразы, в частности при утрате отдельных субъединиц.
Вторая стадия процесса — начало синтеза, инициация — достаточно четко отграничена от стадии присоединения энзима к ДНК. В нее входит, во-первых, присоединение начального нуклеозидтри-фосфата к первому центру энзима, который специализирован на взаимодействии с З'-ОН-группой рибозила; во-вторых, присоединение второго нуклеозидтрифосфата к расположенному рядом второму центру энзима, который называют центром связывания субстрата (некоторая условность этого названия очевидна, ибо I центр тоже связывает один из субстратов), и, в-третьих, замыкание первой фосфодиэстерной связи с отщеплением пирофосфата (см. схему 5). Включение этой последней реакции в стадию инициации требует некоторых пояснений, так как при этом уже происходит наращивание цепи и ее можно по этому признаку отнести к элонгации. Однако ингибиторный анализ указывает на существенные отличия первой реакции от последующих. Яды, подавляющие инициацию, причем именно образование первой фосфодиэстерной связи, не влияют или мало влияют на элонгацию и, напротив, ингибиторы элонгации, как правило, не тормозят инициации (ингибиторы матричного синтеза описываются ниже в специальном разделе). Видимо, проявляются неодинаковые условия катализа реакции присоединения второго нуклеотида к начальному НТФ и последующих реакций присоединения к олигонуклеотиду.
Образование комплекса минимальный энзим —ДНК не всегда достаточно для начала интенсивного синтеза даже при наличии субстратов и соответствующих условий среды. В ряде случаев необходим ст-фактор. Роль последнего именно на стадии инициации
подчеркивается данными о том, что после начала синтеза он отделяется и не участвует в процессе роста цепи.
Первый нуклеозидтрифосфат в цепи РНК отличается от последующих не только тем, что не отщепляет пирофосфат, но и тем, что он всегда или почти всегда содержит пурин — аденин или гуанин. Хотя это хорошо согласуется с тем, что участки связывания РНК-полимеразы на ДНК являются пиримидиновыми блоками, есть основания полагать, что этот выбор обусловлен не влиянием матрицы, а свойствами самого энзима.
