Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
1971), отличающаяся от I требованиями ко вторичной структуре матрицы, а также чувствительностью к SH-реагентам и некоторым другим ингибиторам. Близка к последней оказалась ДНК-полимераза, индуцируемая колифагом Т4. ДНК-полимераза тимуса, а также полимераза, индуцируемая колифагом Т5, характеризуются промежуточными свойствами (Gulian, 1971). ДНК-полимеразы обоих типов требуют для начала матричного синтеза свободного З'-конца, но первая способна in vitro вести процесс даже в том случае, когда имеется лишь насечка на одной из цепей ДНК-матрицы, а вторая требует «расчистки» пространства перед З'-концом специальной экзонуклеазой (Knippers et al., 1970; Kornberg, Gefter, 1971) или участия какого-то агента, оттесняющего старую цепь.
Эта особенность ДНК-полимеразы II объясняется отсутствием У нее экзонуклеазной активности, позволяющей «отстригать» нуклеотид, противостоящий с 5'-конца насечки. Наконец, возможны и
более сложные, хотя и дискутабельные пока, варианты репликации с «оттеснением» старой цепи — схема 6-я (Kornberg, 1969; Gulian,
1971).
Однако ДНК-полимеразу II также не удалось связать с процессом редупликации ДНК хромосомы. По-видимому, она, подобно первой полимеразе, участвует в репарации повреждений ДНК и синтезе ДНК эписом. Сейчас наиболее вероятным кандидатом на роль энзима, катализирующего редупликацию хромосомы кишечной палочки, является открытая недавно еще одна — третья ДНК-полимераза, которая особенно активна в среде с низкой диэлектрической константой, характерной для условий, существующих в мембранных образованиях клетки. Она также отличается большей термолабильностью и чувствительностью к N-этил-малеимиду, высокой активностью в присутствии сульфата аммония и некоторыми другими особенностями (Gefter, Kornberg,
1972). Подобно второй полимеразе она требует для синтеза на матрице биспиральной ДНК не только насечек, но и частичной деградации или отклонения цепи с б'-края насечки.
Все изложенные особенности действия ДНК-полимераз позволяют понять, почему участия только этих энзимов недостаточно для полного воспроизведения исходной двуцепочечной ДНК. Если последняя не повреждена, то необходим, кроме полимеразы, энзим для образования «насечки» на одной из цепей. Более того, даже при наиболее благоприятной локализации насечки зона, где затравочная цепь связана с матричной, может остаться нередуплицированной. Наконец, даже при кольцевой структуре матриц для полного их воспроизведения требуется участие энзимов, способных «сшивать» концы полинуклеотидных цепей. Нельзя также считать достаточно выясненным вопрос о механизме локальной денатурации биспиральной цепи ДНК-матрицы при синтезе по последнему — 6-му варианту схемы 3. Биспиральная структура слишком стабильна, чтобы считать достаточно вероятной самопроизвольную денатурацию участка на пути движения полимеразы. Высказывались предположения, что локальная денатурация является одной из функций самой лолимеразы. Однако в последнее время появились данные о существовании специальных факторов, обеспечивающих «расплетение», локальную денатурацию биспиральной ДНК. Один из факторов кишечной палочки оказался белком с молекулярным весом 22000, обладающим очень высоким сродством к одноцепочечной, но не двуцепочечной, ДНК. Это свойство приводит к резкому смещению вправо положения равновесия в реакции ДНКдвуцепоч.^ДНКодноцепоч.. В частности, значительно снижается температура плавления ДНК, особенно в участках, богатых АТ-па-рами. Любопытна высокая степень специфичности данного фактора — он сотрудничает только с ДНК-полимеразой И, но не с I или III (Sigal et al., 1972). Подобен этому фактору, хотя и не идентичен ему, расплетающий белок, индуцируемый фагом Т< (продукт гена № 32). Он опять-таки специфичен — обслуживает лишь полимеразу фага, но не клетки-хозяина (Alberts, Frey, 1970;
м
Huberman, Kornberg, 1971; Carroll et al., 1972). Для того же коли-фага удалось оценить общее число генов, обеспечивающих так или иначе редупликацию ДНК. Оно оказалось очень большим — около двух десятков (Huberman et al., 1971). Отсутствие в опытах in vitro большого числа энзимов и факторов, которые, помимо полимеразы, необходимы для полной редупликации ДНК, было в свое время причиной неудач при попытках синтеза биологически активных ДНК с помощью одной лишь ДНК-полимеразы и матрицы. Их нередко относили за счет неточности матричного синтеза in vitro. Теперь, когда причины этих неудач понятны, очевидно, что они не дискредитируют представлений о ДНК-полиме-разе как об энзиме, катализирующем практически без ошибок синтез комплементарной матрицы полидезоксинуклеотидной цепочки, как in vivo, так и in vitro.
Природа энзима типа I изучена довольно основательно. Он состоит из единственной полипептидной цепи весьма значительного веса—109000. Выдвигались предположения о том, что полипеп-тидная цепь образует кольцеобразную структуру с диаметром около 65 А. Они хорошо согласуются с полученными недавно электронно микроскопическими наблюдениями: ДНК-полимераза оказалась сферической молекулой именно такого диаметра (Griffith et al., 1971). Энзим содержит один дисульфидный мостик и одну свободную SH-группу. Отношение последней к каталитической активности не вызывает сомнений, но тем не менее йодацетат и ионы ртути не снижают активности ДНК-полимеразы I. Аминокислотный состав энзима не имеет каких-либо примечательных особенностей, С-концевая аминокислота—метионин. Возможно, N-конце-вая аминокислота маскирована при образовании упомянутой гипотетической кольцевой структуры. Энзим обладает высоким сродством к З'-ОН-концевым нуклеотидам в области «насечек» на одной из цепей биспиральной ДНК, а также к различным участкам одноцепочечных ДНК. Однако циклическая биспиральная ДНК без «насечек» совсем не связывает полимеразу. Число «насечек» практически совпадает с максимальным числом молекул энзима, способных связаться с данной ДНК. Все это хорошо согласуется с изложенными выше условиями матричного синтеза. Синтез ДНК из НТФ с образованием пирофосфата, обратная реакция — пирофосфоролиз ДНК, а также упоминавшаяся выше реакция обмена пирофосфатного остатка НТФ на неорганический пирофосфат, катализируются одним и тем же центром активности. В частности, последняя реакция является, очевидно, следствием многократного чередования актов присоединения и пирофосфоро-литического отщепления единичного нуклеотида. Эта же область энзима ответственна за 3'—>5/-экзонуклеазную активность. 5'—>-3'-экзонуклеазная активность связана с особым участком. При мягком протеолитическом гидролизе Kornberg и сотр. удалось расщепить полимеразу на два фрагмента (Setlow et al., 1972; Setlow, Kornberg, 1972; Brutlag, Kornberg, 1972). Первый, составляющий около двух третей исходной молекулы, обладал
