Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
3 И. П. Ашмарин
65
полимеразной и 3'—»-5'-экзонуклеазной активностями. Второй фрагмент обладал только 5'—*-3/-экзонуклеазной активностью. В состав центра, к которому присоединяется З'-конец строящейся цепи и нуклеозидтрифосфат, входят все серусодержащие остатки полимеразы. Пока трудно назвать другие случаи, когда энзим является ковалентно сопряженным объединением других, самостоятельных, в сущности, энзимов. Чаще встречаются нековалентно сопряженные, относительно рыхлые, ассоциаты ферментов.
Содержание ДНК-полимеразы I в Е. coli довольно значительно — около 400 молекул на клетку, причем процедура ее выявления и выделения не связана с особыми трудностями. Напротив, ДНК-полимеразы II и III оказались очень прочно связанными с мембранами клетки, нестабильными при выделении и чувствительными к SH-реагентам. Эти обстоятельства и определили трудности исследования этого типа полимераз. Как уже указывалось, ДНК-полимераза II не обладает экзонуклеазной активностью и, даже при наличии «насечек» на ДНК-матрице, требует участия экзонуклеазы или фактора, расплетающего ДНК.
Долгое время сведения о ДНК-полимеразах высших организмов были весьма ограничены. Однако и там уже обнаружен ряд полимераз, существенно различающихся по свойствам даже в пределах одной ткани. Так, из клеток эукаритов выделены ДНК-полимеразы с молекулярным весом 150—160000 и 200000, подавляемые N-этилмалеимидом и S//-блокирующими агентами и не обладающие нуклеазной активностью. Из тех же клеток выделены одновременно ДНК-полимеразы с неожиданно низким молекулярным весом — 30—40 000, несколько отличающиеся по оптимальным условиям действия и отношению к ингибиторам (Smith, Gallo, 1972, и др.). Подобная по размеру ДНК-полимераза выделена сейчас в высокоочищенном виде и из куриных эмбрионов, ее молекулярный вес — всего лишь 27 000. Весьма интересно также то, что последняя способна функционировать на матрице гибридных ДНК-РНК биспиральных молекул и строить дочернюю цепь ДНК на матрице РНК-цепи (Stavrianopouls et al., 1972).
НК-ЛИГАЗЫ
Существование энзимов, способных соединять полинуклеотид-ные цепи конец в конец, установлено сравнительно недавно (Gel-lert, 1967), причем стимулом к их выявлению послужили именно неудачи в синтезе биологически активных ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Наиболее изученная ДНК-лигаза из Е. coli (Gulian, 1971) катализирует реакцию образования сложноэфирной связи между концевыми З'-ОН- и 5'-фосфорильными группами двух полидезоксирибонуклеотидных цепей. При этом обе соединяемые цепи должны быть расположены на комплементарной им обеим непрерывной цепи, т. е. входить фактически в состав единой биспиральной молекулы ДНК — так, как это показано на схеме 4. В последне время описана способность лигаз соединять
биспиральные фрагменты ДНК, а также ликвидировать, разрывы цепей в природных смешанных молекулах, состоящих из комплементарных цепочек РНК и ДНК. В последнем случае действие лигазы может распространяться не только на полидезокси-, но и на полирибонуклеотидную цепь. Однако скорость этих процес-
а
\
К, \ ы \ \ \
фч л
>
\
ф.
\
п п п п п
II I I I
п п п п п
\
ф
N
\
ф
ч
N
НАД
ф
N
Ч
S'
ф.
гОН
Ф.
\
Ф.
N
Ф.
Нрибф + АМФ
М 41 S| N
ДНК—ЛИГ44а
( E.coli, B.Subtilis )
\
\
Ф
\
‘Ф,
\
N
Ф.
N
Ф,
N Ч Ч
К
Ф.
Ч
Ф,
\
п п п п п п п
I I I I I I I
п п п п п п. п
ч
'Ф,
\
ч
Фч
ч
¦ф,
N TN
Ч* ч
чф
ч
'ф.
ч
ч
ф
ч
ч
ф
ч
\
(I) е+над=амф~ё +нрнбф
(2) АМФ^Е +
(АМФ)
(3)
ГййГ-Г MJ HJ -
(АМФ)
6-
Схема 4. Схема действия ДНК-лигазы (П-основания ДНК, НрибФ —
никотинамидомононуклеотид). а — общая схема; б — более детальная схема реакций (Е — энзим)
сов сравнительно невелика—1—2% от скорости соединения единичных дезоксирибонуклеотидных цепей в биспиральной ДНК (Gulian, 1971; Fareed, 1971). Разрывы в биспиральных РНК не воссоединяются ДНК-лигазой.
Действие лигазы по конечному результату является обратным реакции образования «насечки» на одной из цепей биспиральной ДНК. По механизму же лигазная реакция существенно отличается от простого обращения гидролиза. Для ее протекания
требуется источник энергии. В случае лигазы Е. coli и В. subtilis им служит распад НАД на АМФ и никотинамид мононуклеотид; это несколько необычный источник энергии. Правда, сам НАД образуется за счет АТФ. Лигаза колифагов и клеток млекопитающих требует привычного источника энергии — аденозинтрифосфата.
Молекулярный вес ДНК-лигазы относительно o'ieHb велик — около 100000, но в отличие от ДНК-полимеразы она, по-видимому, состоит из субъединиц меньшего веса.
Лигаза является обязательным участником процессов редупликации ДНК in vivo. Очевидна также необходимость лигазы для репарации повреждений ДНК. С этими функциями связано высокое ее содержание в Е. coli — около 2000 молекул на клетку, т. е. даже больше, чем ДНК-полимеразы I.
