Введение в методы микроскопического исследования - Аппельт Г.
Скачать (прямая ссылка):
Сила цветного свечения различна, но обычно сравнительно слабая, так что глаза должны адаптироваться к темноте (поэтому следует работать в затемненном помещении).
1 Данное определение люминесценции и, в частности, флуоресценции является неполным. Препараты, облучаемые невосприни-маемым глазом коротковолновым светом, поглощают этот свет. Это поглощение света сопровождается переходом атомов вещества в возбужденное состояние. Обратный переход атома из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но другой, большей длины волны. Такой процесс испускания света называется люминесценцией. — Прим. ред.
14.2. ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБЪЕКТЫ И ИХ ОКРАСКА
Флуоресцирующие препараты могут проявлять первичную или собственную флуоресценцию. В этом случае им свойственно флуоресцировать при облучении коротковолновыми лучами света. Другие имеют вторичную флуоресценцию. Они флуоресцируют при облучении коротковолновыми лучами света только тогда, когда обработаны особыми химикалиями, так называемыми флуорохромами. Флуоро-хромы представляют собой определенные красящие вещества, которые употребляются в виде сильно разбавленных растворов. Препараты погружают в эти растворы на время от нескольких секунд до нескольких часов.
В качестве среды для заключения объектов годятся только воздух, вода и глицерин или парафиновое масло. Другие вещества непригодны, потому что сами флуоресцируют и вуалируют изображение. Но наиболее ярко видны флуоресцирующие объекты, находящиеся в воздушной среде. Отдельные части препаратов со вторичной флуоресценцией воспринимают флюорохромы в различной степени, благодаря чему они флуоресцируют с различной интенсивностью.
Для ориентировки сопоставлены наиболее пригодные для исследования объекты.
1. Гистологические препараты (исследования клеток).
2. Бактерии и вирусы.
3. Прижизненное исследование живых микроорганизмов в микроскопах с падающим светом после инъекции флуоресцирующих веществ (флуоресцин, трипафлавин, акрифла-вин). При этом может наблюдаться перемещение, накопление и выделение этих веществ.
4. Исследования текстиля.
5. Исследования в области физиологии растений.
6. Исследования коллоидов. Окраска коллоидов производится эозином, флуоресцином или сафранином. На пути осветительных лучей включается фильтр из кюветы толщиной 7 мм с раствором из 0,15 г метиленового синего на 300 мл воды. Кроме этого, необходимы исследования методом ультрамикроскопии.
7. Химикалии, металлы и петрографические объекты, заключенные в глицерин или воду.
8. Наружные поверхности металлов.
9. Судебные исследования с целью определения подделок почерка, текста или денежных знаков.
10. Радиоактивные вещества, которые флуоресцируют благодаря явлениям радиоактивного распада без облучения ультрафиолетовым светом.
Коротковолновые лучи, необходимые в флуоресцентной микроскопии, большей частью проходят сквозь стекло.
Поэтому для обыкновенных исследований пригодны нормальные предметные и покровные стекла. Однако для некоторых объектов рекомендуется употреблять предметные стекла из кварца, сквозь которые беспрепятственно проходят ультрафиолетовые лучи.
Принимая во внимание большое значение флуоресцентной микроскопии, я хотел бы в дальнейшем изложить отдельные методы флуорохромирования, заимствованные большей частью из рецептов и таблиц, которые рекомендовала для флюорохромирования в 1951 г. фирма Рейхерт в Вене.
Из флюорохромов там названы: акридиновый желтый экстра, акридиновый оранжевый N О, аурамин, аурофосфин G, сернокислый берберин, бриллиантовый дианил зеленый G, бриллиантовый фосфин G экстра, бриллиантовый с ульфоф-лавин, экстракт хелидониума, экстракт хлорофилла, кори-фосфин О, эйхризин 2 GNX, фуксин, нафталиновый красный, раствор метиленового голубого по Леффлеру. метиловый зеленый 00, морин, нейтральный красный В экстра-фосфин 3R, примулин О, родамин В, родамин 6G, тиазин красный R и тиофлавин S.
Большинство красителей растворяют в дистиллированной воде, а некоторые — в спирте. В ряде случаев растворы красителей должны иметь определенное значение pH.
‘•Для фиксации биологических объектов, в частности, пригоден 35% раствор формалина, разбавленный дистиллированной водой в пропорции 1 : 10. Можно употреблять замороженные, парафиновые и целлоидиновые срезы.
При парафиновых срезах нельзя применять для приклеивания к предметному стеклу белок с глицерином, обладающий собственной флуоресценцией. Чтобы целлоидиновые срезы были пригодны для флуоресцентной микроскопии, они не должны содержать целлоидина. Его удаляют с помощью смеси эфира со спиртом. После флуорохромирования срез на предметном стекле промывают водой из пипетки и высушивают фильтровальной бумагой. Это промывание повторяют до тех пор, пока не будет удален весь краситель. Препараты, требующие длительного хранения, помещают обыкновенно в парафиновое масло, а препараты, которые можно после исследования уничтожить, кладут в глицерин.
Ниже приводятся некоторые специальные рецепты.
