Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
Абсорбция растворов хинина, как и в случае акридина, с уменьшением pH смещается в видимую часть спектра.
Из приведенных данных следует, что при применении методов люминесцентного анализа к двухосновным соединениям типа хинина должны быть соблюдены те же условия, какие были указаны в отношении акридина-без этого мы не можем рассчитывать на получение однозначного решения аналитической задачи.
Сказанное об основаниях может быть в полной мере отнесено и к кислотам. Если из слабой кислоты приготовить ряд растворов с возрастающей кислотностью, то флуоресценция их будет закономерно изменяться: в кислых растворах мы наблюдаем флуоресценцию недиссоциированных молекул кислоты, в щелочных - флуоресценцию ионов кислоты, в промежуточных - сумму обеих флуоресценций с преобладанием той или иной
40
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ
[ГЛ. Ш
из них, в зависимости от раствора. Так, в водных растворах флуоресцеина, представляющего слабую кислоту, типичная яркая флуоресценция желтозеленого цвета обнаруживается только в щелочном растворе, когда светится анион кислоты. С понижением щелочности раствора свечение становится слабее. Флуоресцеин содержит помимо карбоксильной группы СООН еще фенольные группы ОН; в кислом растворе ему иногда приписывают образование положительного иона. Кроме того, в сернокислотных растворах его пироновое кольцо вступает, быть может, в непрочную связь с молекулами серной кислоты. Поэтому в растворах флуоресцеина с различной степенью кислотности и щелочности изменения спектров как
абсорбции, так и флуоресценции носят более сложный и запутанный характер. Мы не находим здесь той строгой непрерывности в изменениях спектров с изменением pH, какую наблюдали в разобранных выше случаях акридина и хинина (например, флуоресценция раствора, приготовленного на буфере с pH = 3,6, не является промежуточной между флуоресценциями двух смежных растворов).
В связи со сказанным естественно возникает вопрос: каким образом могло успешно проводиться изучение спектров флуоресценции растворов без учета столь решающего фактора, как влияние концентрации водородных ионов? Ответ ясен. Зависимость флуоресценции от pH раствора выражается кривыми такого же типа, как кривые для цветных индикаторов (рис. 17), т. е. вначале наблюдается медленный рост, затем, после крутого подъема, кривые приходят к насыщению. Поэтому влияние концентрации водородных ионов будет невелико, если наблюдать свечение таких растворов, для которых pH соответствует интервалу значений, где кривая идет почти параллельно оси абсцисс, т. е. молекулы не диссоциированы или диссоциированы полностью [1].
При изучении в аналитических целях растворов, флуоресценция которых изменяется от прибавления кислот и щелочей, необходимо прежде всего дать себе отчет, влияют ли на их флуоресценцию незначительные колебания концентрации водородных ионов, и при положительном ответе надлежит парализовать это влияние путем прибавления кислоты или щелочи. Однако это возможно не всегда, так как во многих случаях самими условиями анализа вызывается необходимость вести наблюдения при определенном pH; применение буферных растворов помогает в этом случае избежать ошибку, которую могло бы вызвать случайное изменение концентрации водородных ионов. Поясним сказанное на конкретном примере: при определении содержания озона в воздухе флуоресцентным методом, по измеряемому нарастанию концентрации акридина в растворе, анализ нельзя вести в щелочном растворе, так как в этих условиях слишком слаба флуоресценция акридина; не годится и кислая среда, так как при малых pH дигидроакридин, окисляемый озоном в акридин, недостаточно индифферентен в отношении кислорода. При применении буфированного
ос
Рис. 17. Зависимость от pH степени диссоциации (а) и соответственно интенсивности окраски индикатора р-нитрофенола (кривая Михаэлиса).
2]
ВЛИЯНИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ
41
реактива удается избежать тех ошибок, которые могли бы быть вызваны изменением кислотности раствора.
Только при соблюдении этих простых правил в отношении условий наблюдения флуоресценции анализируемого раствора можно прийти к определенным сравнимым результатам.
На первый взгляд кажется странным, почему требование учитывать pH раствора приобретает столь существенное значение при применении методов люминесцентного анализа. Казалось бы, что, поскольку абсорбция ионов и недисеоциированных молекул различна, изменение pH раствора должно было бы в равной мере сказываться и на наблюдениях спектров абсорбции. Однако, если учесть специфичную особенность методов флуоресцентного анализа, а именно то, что наблюдения ведут в растворах с исключительно малой концентрацией флуоресцирующего вещества, то станет понятной разница условий. В самом деле, содержание флуоресцирующих веществ в наблюдаемых растворах того же порядка, что и содержание индикаторов в растворах, служащих для определения pH. Поэтому понятно, что незначительные изменения pH должны сказываться на диссоциации и гидролизе наблюдаемых флуоресцирующих соединений несравненно сильнее, чем это имеет место в растворах с такими концентрациями, какие обычно применяются при измерениях абсорбции.
