Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
Tetrahymena
мРНКВТМ + + +
Рис. 5-1. Трансляция мРНК ВТМ в присутствии и в отсутствие разных
компонентов Tetrahymena (задача 5-5).
5-4 От С-конца молекулы фермента бета-лактамазы из В. licheniformis после
того, как он синтезируется, отделяется несколько аминокислот.
Последовательность на С-конце этого фермента можно установить путем
сравнения его с ферментом мутанта, у которого происходит сдвиг рамки
считывания в результате вставки или делеции одного нуклеотида.
Аминокислотные последовательности очищенного фермента из клеток дикого
типа и из клеток мутанта со сдвигом рамки представлены ниже, начиная с
263-го остатка до С-конца:
дикий тип: N М N G К,
мутант: N М I WQICVMKD.
А. В чем заключалась мутация, приведшая к сдвигу рамки?
Б. Определите количество аминокислот в новосйнтезированном ферменте из
клеток дикого типа и, насколько возможно, реальную последовательность для
этого фермента.
5-5 Вы изучаете особенности синтеза белка у одноклеточной инфузории
Tetrahymena. При этом у вас есть как успехи, так и неудачи.
Успехи-это получение первых данных о последовательностях белка и
нуклеиновой кислоты для С-конца одного из белков Tetrahymena:
IMYKQ VAQTQ L *
AUU AUG UAU AAG UAG GUC GCA UAA АСА CAA UUA UGA GAC. UUA
Неудачи состоят в том, что вам не удается провести трансляцию
очищенной мРНК Tetrahymena в лизате ретикулоцитов, который служит
стандартной системой для анализа синтеза белка in vitro. Эту мРНК можно
было считать хорошей по всем критериям, но продуктами ее трансляции были
в основном мелкие полипептиды (рис. 5-1, дорожка 1).
Чтобы разобраться в причинах неудач, вы ставите несколько
контрольных опытов с очищенной мРНК вируса табачной мозаики (ВТМ),
которая кодирует белок с мол. массой 116 кДа. Эта мРНК хорошо
транслируется в системе in vitro; при этом образуется белок с мол. массой
116 к Да- ожидаемый продукт, который на _ электрофореграмме дает основную
полосу,-и белок с массой на 50 кДа больше, который дает очень слабую
полосу (дорожка 2). При добавлении РНК Tetrahymena отмечается
значительное возрастание количества продукта с более высокой мол. массой
(дорожка 3). Когда вы добавляете в систему некоторое количество
цитоплазмы Tetrahymena (без рибосом), мРНК ВТМ дает почти исключительно
продукт с большей мол. массой (дорожка 4); кроме того, к вашему
удовольствию, ранее неактивная мРНК Tetrahymena, по-видимому, начинает
транслироваться (дорожка 4). Вы убеждаетесь в этом, исключая из системы
мРНК ВТМ (дорожка 5).
A. Чем необычна кодирующая последовательность для белка Tetrahymena?
Б. Как, по вашему мнению, образуется минорный продукт с большей мол.
массой за счет мРНК ВТМ в лизате ретикулоцитов?
B. Объясните, почему изменяется соотношение между количествами
основного и минорного белков ВТМ при добавлении только РНК Tetrahymena и
этой РНК вместе с цитоплазмой Tetrahymena. Какие компоненты Tetrahymena
вероятнее всего необходимы для эффективной трансляции мРНК Tetrahymena?
Г. Объясните значение результатов ваших экспериментов с эволюционной
точки зрения.
12 Глава 5
Рис. 5-2. Синтез а- и [3-глобина (задача 5-6).
Рис. 5-3. Гипотетические кривые синтеза глобина при блокировании движения
рибосом на середине молекулы мРНК (задача 5-6).
Рис.
BTN лика мин; деля ды I геля
5-6 Проанализируем эксперимент по изучению координированного синтеза а- и
P-цепей гемоглобина. Ретикулоциты кролика подвергали мечению 3Н-лизином в
течение 10 мин, т. е. достаточно долго по сравнению с продолжительностью
синтеза единичной цепи гемоглобина. Затем с помощью центрифугирования
выделяли рибосомы с прикрепленными к ним растущими полипептид-ными
цепочками, так чтобы в полученном препарате не было свободных
(растворенных) цепочек полностью синтезированного глобина. Растущие
цепочки обрабатывали трипсином, в результате чего получались пептиды с
лизином или аргинином на С-конце. Эти пептиды затем разделяли с помощью
высокоэффективной жидкостной хроматографии и определяли их
радиоактивность. График уровня радиоактивности для каждого пептида в
зависимости от положения остатков лизина в цепи представлен на рис. 5-2.
A. Позволяют ли такие данные сделать заключение о том, какой конец
цепей глобина синтезируется первым? Каким образом?
Б. В каком соотношении синтезируются а- и P-цепи глобина? Можно ли по
этим данным оценить относительное количество молекул мРНК для а- и р-
глобина?
B. Как долго белковая цепь остается прикрепленной к рибосоме после
того, как трансляция достигает кодона терминации?
Г. Ранее предполагалось, что гем присоединяется к растущим глоби-новым
цепям во время их синтеза и что синтез полипептидной цепи на рибосоме
приостанавливается на время присоединения к ней гемовой группы. Прямые
линии на рис. 5-2 указывают на то, что синтез на рибосомах протекает без
заметных пауз, и теперь считают, что гем прикрепляется к уже готовой
