Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка):
Микроинъекции в яйцеклетки
Если необходимо, чтобы все клетки животного содержали новый ген, этот ген нужно ввести в яйцеклетку. Сначала у самки с помошью гормональных препаратов стимулируют образование дополнительных яйцеклеток. Затем оплодотворенные яйцеклетки извлекают из организма матери и с помощью очень тонкой иглообразной пипетки под контролем микроскопа донорную ДНК вводят в один из пронуклеусов. Процесс введения изображен на рис. 25.16. В некоторых (но не во всех) случаях ДНК действительно встраивается в одну или несколько хромосом. Позднее два пронуклеуса сливаются, и яйцеклетка превращается в зиготу. Зиготы переносят в организм одной или нескольких приемных матерей (максимум, два потомка на одну мать), а потом проводят скрининг потомства на присутствие нового гена. Лучший результат, которого удалось добиться в настоящее время, — это одно транс генное животное на каждые 20 обработанных яйцеклеток в случае овец или 100 яйцеклеток в случае коров. Следовательно, для проведения экспериментов нужно содержать большое
Рис. 25.16. Микроинъекция ЛHК в яйцеклетку. Ядра мужской и женской гамет еще не слились и на этой стадии называются пронуклеусами. Они видны в центре яйцеклетки. ДНК вводят в один Ui пронуклеусов с помощью очень тонкой иглообразной пипетки (справа на фотографии). Яйцеклетку придерживают в устойчивом состоянии с помощью другой пипетки (слева). В яйцеюіетку вводят несколько сотен копий фрагмента ДИК.
БОТАНИКА
стадо, что делает процесс получения трансгенных животных очень дорогостоящим. Первые опыты такого рода проводились на кроликах, свиньях и овцах, а за ними последовали крупный рогатый скот и рыбы.
Использование стволовых клеток
В настоящее время все более популярным становится процесс, который является более контролируемым по сравнению с описанным выше. Из раннего зародыша берут несколько клеток, называемых стволовыми, и размножают, помещая на питательную среду. ДНК вводят в эти клетки различными способами, в том числе с помощью микроинъекции. Преимущество данного метода состоит в том, что клетки, в которых экспресси-руется новый ген (т. е. трансформированные клетки), можно идентифицировать до того, как они будут возвращены в материнский организм. Таким образом предупреждается рождение нежелательного нетрансгенного потомства. По-видимому, со временем станет возможным встраивать гены в специфические участки хромосом, что необходимо для их нормальной экспрессии. Это станет особенно важным, если метод будет когда-нибудь испытываться на людях.
Успешно трансформированные клетки возвращают обратно в нормальный зародыш, и они становятся его частью. Развившееся животное представляет собой смесь двух генетически различающихся типов клеток, часть которых произошла от нормальных стволовых клеток, а часть — от трансформированных. Таких животных называют химерами (по названию мифологического животного с головой льва, телом козла и хвостом змеи). Половые клетки химер также будут смешанными, и некоторые из гамет будут нести новый ген. Они дадут начало полностью трансгенным животным в следующем поколении.
Векторы на основе вирусов
В принципе это тот же метод, который используется при работе с фаговыми векторами в случае бактерий. Плазмидные векторы нельзя использовать, так как клетки животных не содержат плазмид. Метод не применяют на яйцеклетках, а используют только в тех случаях, когда нужно трансформировать некоторые клетки организма, например при генной терапии (разд. 25.7.11).
ММА им. И.М. Сеченова
_Прикладная генетика 235
Прямое поглощение ДНК
В правильно подобранных условиях фрагменты ДНК могут быть поглощены клеткой с помощью фагоцитоза. Этот процесс более эффективен, если ДНК приготовлена в присутствии фосфата кальция. Данный метод подходит для генной терапии, когда необходимо модифицировать только некоторые клетки в организме. Можно использовать альтернативный процесс, называемый электропорацией, когда клетки стимулируют кратковременным импульсом слабого электрического тока. При этом в клеточной мембране образуются временные отверстия (поры), и она становится проницаемой для ДНК.
Липосомы
Липосомы представляют собой искусственно созданные сферы (пузырьки), окруженные подобно мембране фосфолипидным бислоем. ДНК, которую необходимо ввести в клетки, содержится в липосомах. Липосомы слипаются с клетками и проникают в них (см. разд. 25.7.11).
25.5.2. Белковые препараты
медицинского назначения, получаемые из молока
Одно из наиболее перспективных направлений генной инженерии — «выращивание лекарств на ферме», т. е. получение относительно больших количеств редких и дорогих белков, применяемых в медицине, из молока трансгенных коров или овец. Дело в том, что не все лекарственные препараты можно получить с помощью бактерий тем способом, который описан для инсулина и гормона роста человека. Во многих случаях для экспрессии белка необходима очень точная его укладка или модификация с использованием аппарата, имеющегося только в клетках млекопитающих. Так, к некоторым аминокислотам белка фактора IX уже после его синтеза должна добавляться группа —СООН. Крупномасштабное культивирование клеток, продуцирующих эти белки, теоретически возможно, однако оно потребует больших затрат и технически трудно выполнимо.
